[发明专利]用于检测猪圆环病毒3型的引物及探针、荧光定量PCR试剂盒及方法、应用

说明书

技术领域

本发明涉及病毒PCR检测技术领域，特别涉及一种用于检测猪圆环病毒3型的引物及探针、荧光定量PCR试剂盒及方法、应用。

背景技术

猪圆环病毒（Porcine circovirus, PCV）属于圆环病毒科、圆环病毒属，是一种无囊膜的单股环状DNA病毒，也是目前发现的最小的动物病毒。PCV具有两个血清型，即PCV-1和PCV-2。PCV-1是一种可以感染猪的常规病毒，对猪无致病性。PCV2于1998年首次报道，对猪具有致病性，在临床上主要引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（Post-weaning multisystemic wasting syndrome, PMWS）、皮炎-肾病综合征（Porcine dermatitis and nephropathy syndrome, PDNS）、繁殖障碍以及呼吸道和肠道疾病，对全世界的养猪业造成了重大的经济损失。

2016年美国报导出现一种新的圆环病毒血清型-PCV3，该病毒能引起猪的皮炎肾病综合征、繁殖障碍及心脏和多系统的炎症反应。目前PCV3病毒尚未分离成功，致病性也未进行深入研究。分子流行病学调查结果显示PCV3在美国猪群中广泛流行。2016至2017年，我国安徽、福建、河北、河南、山东和重庆等地也相继检测到PCV3的存在。目前，PCV3在我国猪群中的发病情况及流行情况并不清楚，因此尚未出现任何一种能够快速、准确的检测到PCV3的检测试剂。建立一种快速、准确的PCV3实验室诊断方法对于进一步了解PCV3在我国猪群中的流行情况具有重要意义。

发明内容

为了能够提供一种快速、准确的检测PCV3的检测试剂，为PCV3的快速检测及其流行病学调查以及预防和控制我国PCV3的流行提供快速、简便和可靠的技术工具，本发明提供了一种用于检测猪圆环病毒3型的特异性引物及探针、荧光定量PCR试剂盒及方法、应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供了一种用于猪圆环病毒3型特异性检测用引物及探针，其中：

所述引物的核苷酸序列如下：

上游引物： 5' ACGTCGGGAAATCTGACTGAA 3'，

下游引物： 5' CCGCCCATAGCGTATAAATACTG 3'；

所述探针的序列如下：

5' FAM-TTGCGGAGAAGATG-MGB 3'。

为了更好的实现上述发明目的，本发明还提供了一种用于检测猪圆环病毒3型的荧光定量PCR检测试剂，所述试剂包括以下组分：反应混合液、水和用于猪圆环病毒3型特异性检测用引物和探针；

所述引物的核苷酸序列如下：

上游引物： 5' ACGTCGGGAAATCTGACTGAA 3'，

下游引物： 5' CCGCCCATAGCGTATAAATACTG 3'；

所述探针的序列如下：

5' FAM-TTGCGGAGAAGATG-MGB 3'。

其中，所述反应混合液为TaKaRa公司生产的Premix Ex Taq（Probe qPCR）。

所述水为TaKaRa公司生产的RNase-free Water。

一种制备检测猪圆环病毒3型的荧光定量PCR试剂盒，为含有权利要求2-4任一项所述的荧光定量PCR检测试剂的试剂盒。

所述引物和探针或所述试剂或所述试剂盒，在检测猪圆环病毒3型或制备检测猪圆环病毒3型检测产品中的应用。

为了更好的实现上述发明目的，本发明还提供了一种用于检测猪圆环病毒3型的荧光定量PCR检测方法，所述检测方法包括：

（1）设计及合成引物和探针；其中，所述引物的核苷酸序列如下：

上游引物： 5' ACGTCGGGAAATCTGACTGAA 3'，

下游引物： 5' CCGCCCATAGCGTATAAATACTG 3'；

所述探针的序列如下：

5' FAM-TTGCGGAGAAGATG-MGB 3'；

（2）制备阳性质粒标准品；

（3）进行荧光定量PCR反应条件的优化，建立荧光定量PCR检测体系；

（4）采用荧光定量PCR检测体系对病毒进行检测。

其中，所述步骤（2）具体为：

用DNA/RNA核酸共提试剂盒分别提取内脏组织匀浆、病毒培养物和血清的DNA，溶于20μL RNase-free water，所得DNA可直接用于荧光定量PCR或置-20℃保存备用；