[发明专利]一种以红根草花序为外植体诱导其不定芽的方法

说明书

本发明公开了一种以红根草花序为外植体诱导其不定芽的方法，通过选取红根草花葶抽生的未开放幼嫩花序作为外植体，用软毛刷沾取洗衣粉水溶液轻轻刷洗表面灰尘，在混合消毒液中进行消毒预处理后；在转入超净台中，先用75%酒精进行表面消毒，再将外植体浸泡于升汞和吐温混合液中消毒，最后用无菌水冲洗3‑4次，获得无菌的幼嫩花序，接种于初代培养基中进行不定芽的诱导。本发明方法解决了红根草组织培养中外植体采集时间短、量少、消毒困难和褐变率高的问题，可保证获得充足的外植体，并可有效降低红根草外植体的污染率，提高外植体的存活率。

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，具体是一种以红根草花序为外植体诱导其不定芽的方法。

背景技术

红根草（Salvia prionitis Hance）具有抗菌解毒、清热除湿、抗结核、抗肿瘤等功效，为国家重点保护中药品种“复方红根草片”的主要原料。从红根草中提取的红根草邻醌作为关键中间体经化学修饰，形成二萜醌类化合物沙尔威辛，具有抑制肺癌、胃癌、卵巢癌、肝癌、结肠癌和宫颈癌等癌细胞生长，阻断其修复再生通路的双重作用，并具有毒性低、抗耐药和抗转移等特性，被认为是有望成为我国具有自主知识产权的抗肿瘤新药。

红根草种子在自然状态下发芽率极低，近年来，由于环境变化、企业大量收购和产区群众大量采挖，红根草野生资源濒临枯竭，严重影响了红根草在临床上的应用，对红根草进行组织培养和快速繁殖迫在眉睫。

对外植体进行消毒并获得无菌体系，是组织培养和离体快繁的重要环节，对规模化生产具有十分重要的意义。红根草全株被柔毛，进行消毒处理时，外植体表面张力增大，消毒剂不易渗透，造成外植体消毒不彻底，污染率高，无法获得无菌外植体；或是造成外植体消毒过度，使外植体发生褐变和丧失活力，大大降低了外植体组织培养的成活率。

目前，关于红根草组织培养的报道仅有两篇。

黄炼栋（黄炼栋，徐寅泽，胡之璧．红根草的离体快速繁殖．《植物生理学通讯》[J]．1988， 34（5）：365．）公开了一种利用红根草茎节作为外植体，自来水漂洗30s，75 %酒精浸泡60 s，0.1% HgCl₂消毒20min，获得无菌外置进行快速繁殖的方法，但文中未提及外植体消毒效果如何。

唐凤鸾（唐凤鸾，李锋，付传明．红根草的组织培养与快速繁殖研究．《广西植物[J].2006，26(3)：282-285．）通过实验证明，红根草的茎节、茎尖、植株抽茎前的生长点用自来水冲洗干净，然后用纱布轻轻擦去材料表面的污物，放在800倍甲基托布津溶液中浸泡20min，75％酒精浸泡1 min ，0.1% HgCl₂处理5～10 min，无菌水冲洗5～6遍后进行接种，结果三种外植体的污染率分别高达46.7%、60%和85%，表明外植体消毒效果不佳。

可见红根草植物尚未建立较为成熟的组织培养体系，红根草为多年生草本，当年生植株只有一个生长点，一般不萌发侧芽，其基生叶贴近地表处，有成对交叉的短茎，短茎的高生长极不明显（唐辉,赵瑞峰,蒋水元,蒋运生,陈宗游. 红根草生物学特性研究[J].中药材,2008,No.29610:1464-1467.），目前文献报道红根草离体培养主要取材茎节、茎尖和植株抽茎前生长点，不仅外植体来源不足，而且这些外植体所在植株部位均靠近地面，导致外植体消毒不彻底，污染率高，这在很大程度上限制了红根草的产业化发展。而红根草花期为4月至6月，其花序为聚伞式， 花期花序数量多，于4月下旬至5月中旬取材可获得数量较多的未开放的幼嫩花序，满足离体取样的需要。目前尚无利用红根草花序作为外植体进行不定芽诱导的报道。

鉴于上述消毒效果不理想，难以获得较高成活率的外植体，本发明选取生长健壮的红根草花葶抽生的未开放幼嫩花序作为外植体，提供一种以花序为外植体诱导红根草不定芽的方法，为红根草的快速繁殖提供参考。

本发明可以降低外植体的褐变率，提高外植体的成活率，也适用于带绒毛外植体的消毒。

发明内容