[发明专利]用于检测胆道闭锁患儿血浆miR‑140‑3p的引物组及包含该引物组的检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及引物及试剂盒，具体涉及用于检测胆道闭锁患儿血浆miR-140-3p的引物组及包含该引物组的检测试剂盒。

背景技术

胆道闭锁(biliary atresia，BA)是婴幼儿时期引起胆汁淤积性黄疸的常见疾病。BA是累及肝内外胆道系统的进行性炎性病变，最终导致肝外甚至肝外胆管消失，出现肝脏纤维化、门静脉高压等并发症，最终危及患儿生命。若不予早期及时手术治疗，自然死亡率可达100％。故早期筛查、诊断以及肝纤维化评估对BA患儿预后、有效降低地区新生儿死亡率有重要意义。然而目前BA依然缺乏特异且有效的实验室诊断和筛查指标，如何能够早期且无创性诊断仍是世界性难题。

miRNA是近年来新发现的具有多基因调控功能的非编码单链小RNA，在细胞生长、代谢、增值、分化、细胞凋亡、病毒感染、肿瘤发生等生物学功能中发挥重要的作用。研究证明外周血循环中存在着丰富且稳定的miRNA。循环miRNA在血清/血浆等体液中以稳定的形式存在。有研究提示miRNA在BA的发生发展过程中起重要作用，涉及到疾病相关免疫细胞的发育分化，细胞表面分子的表达及细胞因子的释放，也可通过肝胆细胞的增值、凋亡、代谢等相关通路影响BA肝纤维化的进展。这就使得循环miRNA这一无创性的检查作为BA的早期诊断、病理分级、预后评估和发病机制的研究开启了新的思路。发明在前期通过对BA患儿、胆汁淤积性患儿及健康婴幼儿的血浆进行高通量测序分析，发现miR-140-3p在BA患儿中特异性下调。

目前，miRNA的检测方法有多种，包括northern blot技术、原位杂交技术、实时荧光定量PCR技术、微阵列芯片技术以及最新的高通量测序技术。其中northern blot是用于RNA检测的早期手段之一，但其检测的敏感性和特异性较低，当血浆样本中RNA含量低或存在RNA降解时，可能检测不到。并且操作步骤繁琐，不适用于高通量分析。原位杂交技术主要用于检测细胞水平和组织水平miRNA的分布情况，并进行半定量分析，但是不能准确的检测低表达量的miRNA是其不足之处。微阵列芯片技术是一种高通量的检测技术，能同时检测一种或多种样本中大量的大量的miRNA，单芯片上不同的探针分子和待测分析之间容易发生交叉反应，使得测定结果准确性低，重复性差。新一代的高通量测序技术准确度高、可重复性好，但是检测成本高，不利于推广。

实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术是目前最常用的基因检测技术之一，具有灵敏度高、特异性好，操作方法简便快捷等优点。RT-qPCR包括RNA的逆转录和下游的PCR两部分，逆转录根据引物设计的不同分为poly(A)聚合加尾法和茎-环状引物反转录法。荧光定量PCR两部分分为染料法和探针法，探针法虽特异性好，但是每种miRNA都需要设计相对应的TaqMan探针，成本高，不利于推广应用。染料法基于-环状结构的逆转录引物能特异识别并扩增成熟的miRAN序列，且经济实惠。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种用于检测胆道闭锁患儿血浆miR-140-3p的引物组。

本发明的目的之二是提供包含上述引物组的检测试剂盒。

本发明的引物组是根据BA中低表达的miR-140-3p基因序列进行设计的。在本发明中，所述的引物组为：

逆转录引物(RTprimer)：

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCCGTGG

正向引物(Forward primer)：TGCCGTACCACAGGGTAGAAC

反向引物(Reverse primer)：CAGTGCAGGGTCCGAGGTAT。

本发明提供的包含上述引物组的检测试剂盒，包括RNA提取试剂瓶、茎环逆转录试剂瓶和荧光定量PCR试剂瓶。

RNA提取试剂瓶内装血浆RNA提取试剂，茎环逆转录试剂瓶内装茎环装逆转录试剂、荧光定量PCR试剂瓶内装荧光定量PCR试剂。

所述荧光定量PCR试剂包括如下组份： Premix Ex TaqⅡ(2×)、ROX Reference DyeⅠ(50×)、ROX Reference DyeⅡ(50×)、灭菌好的dH₂O、10μM的特异性正向引物SEQ ID NO：2、10μM的特异性反向引物SEQ ID NO：3。