[发明专利]一种MDCK-MDR1的药物吸收筛选体系及其构建方法

说明书

本发明公开了一种MDCK‑MDR1的药物吸收筛选体系及其构建方法，针对MDCK细胞中犬P‑gp基因设计出了sgRNA，将设计的sgRNA序列合成Oligo，构建sgRNA表达载体；将人源MDR1基因转染至MDCK‑KO细胞中，筛选扩大阳性单克隆；蛋白免疫印迹法检测p‑gp蛋白表达，成功表达者即表示MDCK‑MDR1的药物吸收筛选体系构建成功。本发明基于工程技术敲除MDCK细胞中犬P‑gp蛋白的基因，以背景完全“干净”的MDCK细胞作为宿主细胞构建稳定表达人源p‑gp蛋白的MDCK‑MDR1细胞系，从而完善MDCK‑MDR1作为血脑屏障药吸收、转运筛选模型的功能。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，更具体地，本发明涉及一种基因敲除MDCK-MDR1的药物吸收筛选体系及其构建方法。

背景技术

转运体所介导的外源性化合物及其代谢产物的外排是一种非常重要的细胞保护机制，在各种屏障及排泄组织的功能中起到关键的作用。例如肠粘膜、血脑屏障、血睾丸屏障以及肾近端小管和肝脏。几种ATP依赖的(ATP-Binding Cassette,ABC)转运体超家族包括：多药耐药蛋白(MDR1/P-glycoprotein)、乳腺癌耐药蛋白(BCRP)及几种多药耐药联合蛋白家族(MRP)在这些屏障组织中都有高表达，它们在药物体内分布中的重要作用不容争议。

单层膜上皮细胞模型经常被用于研究ABC外排转运体在药物分布中的作用，其中一个常用的细胞系是MDCK。

MDCK细胞系为马丁达比犬肾上皮细胞发展的一种细胞间连接非常紧密的细胞系，低水平表达转运蛋白，低代谢活性。MDCK细胞是在遗传学方面及细胞的脂质、蛋白质组成方面最为理想的上皮细胞系。可用于肾小管上皮细胞的形态和功能的研究，同时其许多生理特性均与血脑屏障(bloodbrainbarrier,BBB)相似，常用于体外药物透过BBB的筛选模型。在研究主动吸收药物的渗透性方面，Caco-2和MDCK之间有很好的相关性，因此用MDCK细胞代替Caco-2细胞作为肠道模型。早在1988年，Pastan等用人类的mdr1基因稳定转染MDCK细胞建立了一个能大量表达P-gp的细胞系。MDCK-MDR1细胞的优点就是培养周期短，可达到代与代间的均一性，获得人P-gp的高表达。细胞表达产生的P-gp主要是位于细胞膜的顶侧。因此，可利用MDCK-MDR1细胞作为肠道黏膜和BBB药物透过的快速筛选模型。

然而，利用MDCK-MDR1细胞作为BBB的模型时也存在一些不足，MDCK分泌较少的犬P-gp，也会影响实验的可靠性。

发明内容

基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种MDCK-MDR1的药物吸收筛选体系及其构建方法。

为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：

一种MDCK-MDR1的药物吸收筛选体系的构建方法，包括以下步骤：

(1)、针对MDCK细胞中犬P-gp基因设计出了sgRNA，用于靶点基因敲除；

(2)、以U6启动子表达sgRNA，将设计的sgRNA序列合成Oligo，构建sgRNA表达载体；

(3)、在对数生长期的MDCK-WT细胞中，加入sgRNA表达载体和GenJet形成的转染复合物，37℃反应20min，加入新鲜培养基，48h后以1：3比例传孔，第二天加800ug/ml的G418进行筛选，大量细胞死亡，停止加药，待细胞进入对数生长期后铺单克隆，每3天换药一次，待细胞大量死亡，降低G418筛选浓度至200μg/ml或撤除G418，15天左右待细胞单克隆长至0.5cm左右进行挑取筛选阳性单克隆；