[发明专利]一种快速检测土霉素孔板发酵液效价的方法

说明书

本发明属于土霉素检测技术领域，具体涉及一种快速检测土霉素孔板发酵液效价的方法。由以下步骤制备而成：制作标准曲线，求得x、y的函数关系式，要求相关系数r>0.999；取土霉素斜面孢子制成单孢子悬液置于深孔板内进行发酵得到土霉素发酵液，将酸化后的土霉素发酵液进行离心，吸取离心后土霉素发酵液的上清液置于96孔酶标板中，加入超纯水稀释100~200倍，然后用酶标仪于290‑292nm下检测吸光值，将检测的吸光值x带入函数关系式中计算得浓度值y，使用浓度值计算得土霉素孔板发酵液效价，本发明检测方法高效，准确。

技术领域

本发明属于土霉素检测技术领域，具体涉及一种快速检测土霉素孔板发酵液效价的方法。

背景技术

土霉素(Oxytetracycline,OTC)是龟裂链霉菌发酵过程中产生的次级代谢产物，具有广谱抑菌作用，是应用较广的广谱抗生素之一；效价检测是菌种筛选过程中费时的环节，减少效价检测时间，可以提高筛选量，更快速的筛选出高产土霉素菌种，现有效价检测方法有药典中规定的高效液相色谱法和企业内部使用的HCl-FeCl3分光光度计检测法，然而高效液相色谱法虽然准确度高但费时，HCl-FeCl3分光光度计检测法比高效液相色谱法检测时间短，但检测效果较差且操作也不简便，因此现有技术需要进一步的改进。

发明内容

本发明的目的在于提供一种更加高效，准确的快速检测土霉素孔板发酵液效价的方法。

基于上述目的，本发明采取如下技术方案：

一种快速检测土霉素孔板发酵液效价的方法，由以下步骤制备而成：

（1）称取土霉素标准品，用0.01mol/L的盐酸溶解配成1000u/ml的母液，然后再用超纯水将配成的土霉素标准品母液分别稀释成5u/ml、10u/ml、15u/ml、20u/ml、25u/ml、30u/ml、35u/ml、40u/ml；

（2）分别吸取200μl步骤（1）中各个浓度的土霉素标品至酶标板中，以超纯水为对照，用酶标仪于290-292nm波长下检测各浓度土霉素标准品溶液的吸收值，以浓度y为纵坐标、吸收值x为横坐标作图，求得x、y的函数关系式，要求相关系数r>0.999；

（3）取土霉素斜面孢子制成单孢子悬液置于深孔板内进行发酵得到土霉素发酵液，每个孔中土霉素斜面孢子制成单孢子悬液体积相同；

（4）向每个孔中的土霉素发酵液加入等体积等浓度的草酸震荡混匀，得到酸化的土霉素发酵液，将酸化后的土霉素发酵液进行离心；

（5）吸取离心后土霉素发酵液的上清液置于96孔酶标板中，所述的每个孔中土霉素发酵液的上清液体积相同，加入超纯水稀释100~200倍，混合均匀后，然后用酶标仪于290-292nm下检测吸光值；

（6）将步骤（5）中检测的吸光值x带入函数关系式中计算得浓度值y，使用浓度值计算得土霉素孔板发酵液效价，计算公式如下：浓度值×稀释倍数=孔板发酵液效价（u/ml）。

进一步的，所述的步骤（3）中，深孔板的为48孔深孔板，并且每个孔中土霉素发酵培养基的体积为1.0~1.2ml。

进一步的，所述的步骤（5）中，孔板的为96孔酶标板，并且每个孔中土霉素发酵液的上清液稀释倍数为100-200倍，体积为200ul。

进一步的，所述的草酸的摩尔浓度为0.5~1.0mol/L。

进一步的，所述的步骤（4）中离心所使用的转速为3000~4000r，离心时间为10~20min。

本发明操作简单，稳定性好，可显著缩短土霉素孔板发酵液效价检测时间，提高土霉素菌种筛选效率。

具体实施方式