[发明专利]基于唾液蛋白质组学的肝癌生物标志物检测的方法

说明书

本发明公开了基于唾液蛋白质组学的肝癌生物标志物检测的方法，具体步骤如下：样品蛋白提取；采用Brad ford法测定提取的蛋白浓度；蛋白酶解；iTRAQ标记；真空冷冻离心干燥；高pH条件下的反相色谱分离；ABI‑5600进行蛋白质分析；质谱数据分析：在选择数据库时，若为已经测序生物，直接选用该物种数据库，若为非测序生物，则选择与被测样品最为相关的大类蛋白质组数据库；采用ABI‑5600型质谱仪进行iTRAQ的质谱分析。本发明能够快速、可靠的蛋白质组学技术方案来发现肝癌中的特异性蛋白标记物，为肝癌早期诊治、术后复发、转移及预后观察建立一种无创、简便、快捷实用的检测评估手段。

技术领域

本发明涉及一种生物标志物检测方法，具体是一种基于唾液蛋白质组学的肝癌生物标志物检测的方法。

背景技术

随着人类基因组计划(human genomic project，HGP)的完成，人们逐渐将研究靶向转变对蛋白质组(proteome)的研究。蛋白质组一词是在1994年由Williams和Wilkins提出，指基因组编码的所有蛋白质，即某一物种、个体、器官、组织乃至细胞的全部蛋白质，强调基因组对应的所有蛋白质构成的整体。2001年，Nature和Science在公布人类基因组草图的同时，分别发表了Abbott和Fields的评述与展望。随之，蛋白质组学的地位提升到了前所未有的高度，被认为是功能基因组学前沿研究战略的制高点、决胜点。蛋白质组学(proteomics)是一种新兴的科学研究技术，其有别于传统的单个基因或单个蛋白的研究模式，而是从整体水平分析机体或细胞全部蛋白质组成成分、表达、修饰、结构功能和相互作用，以及蛋白质和核酸之间的相互作用，对生命的复杂活动有全面和本质的认识，从整体层次上对蛋白质进行动态研究。

蛋白质是生命活动的执行者，是基因表达的产物，其表达、修饰、功能以及彼此相互作用均受到遗传及环境因素的影响，于是机体出现疾病状态必然会引起蛋白质含量或者存在形式的变化，这些变化的蛋白质分子可以为临床疾病诊断的物质基础提供依据。蛋白质组学主要是运用现代先进的检测技术，检测机体从小到一个细胞到大至整个机体的全部基因所表达的蛋白质的特性，比较分析生理或病理状态、用药及不用药状态下的差异表达蛋白质，找出不同状态下个体表达差异的蛋白质，从而为生命的物质基础、疾病的早期检测与诊断等研究寻找分子诊断标志物提供依据。

近年来，随着现代科学及生物化学的微量检测分析技术的发展创新，唾液作为一种临床容易采集而且操作过程完全没有创伤性的体液逐渐进入了人们研究活动的视角，且具有无法估计的科研潜力以及临床应用前景。首先，相比血清标本而言，唾液标本的采集更安全，具有无创性，采集过程中患者无痛苦，易于接受，而且无血源性疾病传播的风险存在；与尿液标本相比，唾液标本具有可实时采样、更方便的优点。此外，唾液检测需要的样本量小、成本低、易于储存和运输。最重要的是，唾液标本成分与血液、尿液等体液成分具有极高的相似性，对疾病诊断具有极强的敏感性和特异性。

唾液是人体常见的一种重要体液，其包涵大量的激素、蛋白质、酶、抗体、补体、细胞因子及各种微生物等血液成分，这些血液成分通过顺浓度梯度被动的跨细胞膜转运或逆浓度梯度的主动转运等途径分泌在唾液当中，且随体内病理生理变化的影响而呈动态变化过程。研究唾液的PH值、电解质、生化指标、微生物、免疫指标、蛋白质等成分变化与疾病的关系，发现唾液成分的变化可作为疾病诊断、疗效判断、药物监测的参考指标，在临床疾病的诊治活动中具有重要的潜在应用价值。根据目前的文献资料显示，唾液不仅能够作为艾滋病、乙型肝炎等传染性疾病、口腔恶性肿瘤及乳腺癌等恶性肿瘤的诊断标志，而且也可以应用于糖尿病、关节炎、心脏病及肾脏疾病等各个系统疾病的诊断，从而成为目前西方国家研究者热衷的取代血清学检查的首选标本。