[发明专利]荧光定量PCR法检测高尔基体蛋白73(GP73)mRNA的试剂盒

说明书

本发明涉及一种实时荧光定量PCR检测高尔基体蛋白73(GP73)mRNA的试剂盒，该试剂盒通过逆转录（RT）mRNA样品得到cDNA,再结合实时荧光定量PCR检测技术，可以定量检测标本GP73的mRNA表达量。本发明所提供的试剂盒可以用于临床及科研中检测患者的外周血中GP73的表达，为原发性肝癌（PHC）的确定及预后的判断提供重要的参考依据。

技术领域

本发明属生物技术领域，为一种通过逆转录(RT) mRNA样品得到cDNA,再结合实时荧光定量PCR检测技术，可以精确定量检测标本中人高尔基体蛋白73(GP73)mRNA的表达量的试剂盒。

背景技术

本发明属生物技术领域，为一种通过逆转录(RT) mRNA样品得到cDNA,再结合实时荧光定量PCR检测技术，可以精确定量检测标本中人GP73 mRNA的表达量的试剂盒。

癌症是严重威胁人类生命和社会发展的重大疾病，列城市死因的第一位，农村死因的第二位。运用科学的方法对癌症进行预防控制已成为全球最重要的公共卫生问题之一。原发性肝癌是在世界范围发病率较高的恶性肿瘤，肝细胞癌已成为一个主要的健康问题，在我国消化系统恶性肿瘤的发病中居第3位，在我国肝细胞癌居恶性肿瘤死亡率的第二位。

早期发现、早期诊断是PHC早期治疗的基础和前提，也是有效提高PHC患者生存率、改善其预后的重要保证。由于癌瘤早期体积微小，采用B超、CT扫描等手段均难以早期发现。血液转移是肿瘤扩散的主要途径之一，因此在患者外周血进行肿瘤细胞基因表达检测、肿瘤特异性标记产物检测是了解肿瘤转移情况的一个有效的方式，因而肿瘤标记物的检测对肿瘤形成及转移的诊断具有极大的帮助。但是在肿瘤转移发生的早期，外周血中的肿瘤细胞很少，无法完全依赖病理形态检查，同时肿瘤特异性抗原的含量也很少，也很难通过常用的ELISA或RIA等方法检测到，因此对循环血中的微量肿瘤细胞基因表达和一些特异产物检测的研究，引起了人们的广泛关注。

聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物技术，是位于体外的特殊DNA复制，能将微量的DNA大幅增加。TaqMan 荧光定量PCR技术及相应检测仪器的推出使得人们可以在利用PCR高灵敏性的情况下，对PCR产物进行实时精确定量检测，不仅解决了PCR的定量问题，而且还大大提高了检测的特异性。因此我们通过荧光定量PCR技术检测外周血中微量肿瘤细胞，荧光定量PCR技术有着病理学或ELISA/RIA等方法无法比拟的高灵敏度和相对的高特异性，为外周血中微量肿瘤细胞的检测带来了希望。

高尔基蛋白73（GP73）是一个新认识的肝癌血清标志物，且在原发性肝癌（PHC）中呈高表达，在正常肝组织中表达低，因此GP73的阳性表达可作为PHC的标志物之一。因而检测外周血中GP73 mRNA的表达能为PHC的确定及预后的判断提供重要的参考依据。

发明内容

本发明试剂盒包含：红细胞裂解液、总RNA抽提试剂、无RNA酶的水、反转录缓冲液、dNTP混合物、逆转录酶储存液、PCR反应液、探针、标准品、对照品；除标准品用TE溶解外，其他各种溶液所用溶剂均为纯化水；

检测用引物分检测用上游引物和检测用下游引物：

上游引物序列为： 5'-GACCTGAGCCAGTGCATCAA-3'；

下游引物序列为：5'-TCTTCTATTCGCTCCTCACACTGT-3'

荧光探针序列为：5'-FAM-CAGATGAAGGAGGTGAAGG-TAMRA-3'

标准品序列为：

AGGATGTCCTCCAGTTTCAGAAGAACCAGACCAACCTGGAGAGGAAGTTCTCCTACGACCTGAGCCAGTGCATCAATCAGATGAAGGAGGTGAAGGAACAGTGTGAGGAGCGAATAGAAGAGGTCACCAAAAAGGGGAATGAAGCTG