[发明专利]一种人脂肪干细胞的分离培养方法和干细胞库的构建方法

权利要求书

1.一种人脂肪干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述方法至少包括脂肪干细胞的原代操作步骤，培养方法使用的培养基由DMEM-F12培养基中添加终浓度为1-20％的胎牛血清、1-100ng/ml的bFGF和1-100ng/ml的EGF制成。

2.如权利要求1所述的人脂肪干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述DMEM-F12培养基中的胎牛血清添加终浓度为10％、bFGF为10ng/ml、EGF为10ng/ml。

3.如权利要求1所述的人脂肪干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述脂肪原代操作步骤包括破碎、清洗、消化、分离、培养步骤。

4.如权利要求3所述的人脂肪干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述脂肪原代操作步骤包括：

破碎，将脂肪组织置于离心管中后用剪刀剪碎，用齿镊剔除肉眼可见的结缔组织，然后离心；

清洗，吸出脂肪，用PBS清洗，清洗后离心，取上层的脂肪层；

消化，用Ⅰ型胶原酶37℃摇床消化；用与消化液等量的含10％FBS的低糖DMEM完全培养基终止消化并轻轻吹打；

分离，离心，移除脂肪层及脂肪组织层，吸取下面的细胞，用网筛过滤；收集滤液于离心管中，离心；

培养，弃去上层脂质层及中间液体层，用所述培养基重悬细胞沉淀后，以1×10⁵～1×10⁷细胞/瓶的密度接种于T75培养瓶中，加入所述培养基，于37.5℃，5％CO₂饱和湿度的培养箱中培养。

5.如权利要求3所述的人脂肪干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述脂肪原代操作步骤包括：

破碎，将脂肪组织置于50ml离心管中后用剪刀剪碎，用齿镊剔除肉眼可见的结缔组织，然后1500r/min，离心5min；

清洗，吸出脂肪，用与脂肪组织等量的PBS清洗两次，清洗后1500rpm/min离心5min，每次清洗完毕后吸取上层的脂肪层；

消化，用与脂肪组织等体积的0.15％Ⅰ型胶原酶37℃摇床消化30min，200r/min；用与消化液等量的含10％FBS的低糖DMEM完全培养基终止消化并轻轻吹打；

分离，1500rpm/min离心5min，移除脂肪层及脂肪组织层，吸取下面的细胞，用200目网筛过滤；收集滤液于50ml离心管中，1500rpm/min离心5min；

培养，弃去上层脂质层及中间液体层，用所述培养基重悬细胞沉淀后，以1×10⁶细胞/瓶的密度接种于T75培养瓶中，每瓶加入所述培养基10ml，于37.5℃，5％CO₂饱和湿度的培养箱中培养。

6.如权利要求3所述的人脂肪干细胞的分离培养方法，其特征在于，还包括传代操作步骤，所述传代操作步骤包括清洗、消化、清洗、离心、培养步骤；

所述传代操作步骤使用的培养基由DMEM-F12培养基中添加终浓度为10％的胎牛血清、10ng/ml的bFGF和10ng/ml的EGF制成。

7.如权利要求6所述的人脂肪干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述传代操作步骤包括：

清洗，取原代培养后的细胞培养液，用PBS洗；

消化，加入胰酶，37℃消化；

清洗，细胞悬液用PBS清洗；

离心，合并洗涤液离心；

培养，倒掉上清，用新鲜的所述培养基重悬细胞，细胞接种量为1×10⁵～1×10⁷每T75培养瓶；37℃，5％CO₂，饱和湿度的培养箱中培养。