[发明专利]用于合成山扁豆酸的工程改造的宿主细胞和方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种用于合成山扁豆酸的工程改造的宿主细胞和方法。更具体的，本发明涉及工程改造的宿主细胞和用于使用所述工程改造的宿主细胞微生物生物合成山扁豆酸的方法。

背景技术

山扁豆酸（Endocrocin），又叫内黄素、内红花素或内向藏花素，主要存在于一些特殊的地衣和真菌中，是一类蒽醌类天然化合物，被认为是生物合成大黄素等活性化合物的重要原料，能够应用于有机合成试剂、染料中间体制备等。山扁豆酸在一些科研中已经被证实对于一些特殊细胞类型具有毒性作用，像是小鼠黑素瘤细胞等，但对于人角化细胞等无影响，因此具有重要的潜在医用价值。经现代化学技术研究分析，山扁豆酸还是中药材大黄的主要有效成分之一，在调理便秘、胃肠道消化不良和其他疾病方面有良好效果。但目前缺少有效获取山扁豆酸的方法，从地衣、真菌或是植物中提取不仅无法获取有效的量，而且容易造成环境的不可修复性破坏。目前也没有任何有效的化学合成方式来获取这种重要的化学物质。而在生物合成方面，山扁豆酸产量等前景仍不具备市场化应用前景。

发明内容

为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种用于合成山扁豆酸的工程改造的宿主细胞，实现低成本高效率获取山扁豆酸。

本发明的另一目的在于提供一种使用工程改造的宿主细胞微生物生物合成山扁豆酸的方法，该方法成本低，工艺简单且生产效率高。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种用于合成山扁豆酸的工程改造的宿主细胞，所述宿主细胞包含以下核酸组合：

EmoA和EmoB；

或者包含EmoA、EmoB和ACC1；

或者包含EmoA、EmoB和ACC1_S1157A。

其中，EmoA(EmoA)是一类能够用于合成蒽醌类化合物，特别是山扁豆酸的非还原性核酮糖聚合酶及其序列。

其中，EmoB(EmoB)是一种硫酯酶，特别是能够用于蒽醌类化合物合成的金属-β-内酰胺酶类型的硫酯酶及其序列。

其中，ACC1(ACC1)/ACC1_S1157A(ACC1_S1157A)——指一种乙酰辅酶A羧化酶（S1157A指定点突变1157位基因使编码由丝氨酸变为丙氨酸）；。

山扁豆酸分子式如下：

优选地，所述宿主细胞为细菌细胞或酵母细胞。

优选地，所述细菌细胞为大肠杆菌。

优选地，所述酵母细胞为酿酒酵母或毕赤酵母。

本发明的另一目的通过下述技术方案实现：

一种宿主细胞合成山扁豆酸的方法，包括以下步骤：

（1）构建及培养宿主细胞，其中所述宿主细胞用EmoA和EmoB；或者用EmoA、EmoB和ACC1；或者用EmoA、EmoB和ACC1_S1157A转化；诱导工程改造的宿主细胞进行上述任意一组核酸组合的表达；

（2）对山扁豆酸进行收集和分离纯化。

优选地，所述宿主细胞为酵母细胞，所述酵母细胞的培养方法包括以下步骤：

A1. 培养所构建的工程菌酵母，先在含有6.7 g/L酵母氮源、20 g/L葡萄糖的酵母SC缺陷培养基中培养，并添加省却成分氨基酸混合物；30℃，250 rpm下培养直至OD₆₀₀达到0.6；

A2. 转移至含有YPD培养基中，根据培养效果调整培养温度、振荡频率和培养时间；

A3. 通过A2步骤培养所得的工程菌酵母在SC培养基中培养，并滴加相应的缺少成分，30℃，250 rpm，直至OD₆₀₀达到1.0，添加入1% 酵母提取物和2%蛋白胨，28℃，250 rpm下持续发酵6~8天，得发酵液；

A4. 发酵液通过3500 rpm离心4-6分钟,收集细胞体，细胞体采用有机物提取，并于离心所得上清液混合后蒸发浓缩，随后进行分析。