[发明专利]一种重组黑曲霉果胶酶及编码基因和制备与应用

说明书

本发明提供了一种重组黑曲霉(Aspergillus niger)果胶酶及其编码基因和高效的制备方法，属于基因工程领域。该方法主要包括以下步骤：将成熟的重组果胶酶基因DNA序列克隆到毕赤酵母的表达载体pPICZαA，并将重组质粒经电转化法整合到毕赤酵母宿主菌X‑33中，即可获得能高效分泌表达、高效降解果胶，高纯度的重组果胶酶，本发明制备的内切果胶酶可广泛应用于食品、药品、生物能源等领域。

技术领域

本发明提供了一种高效分泌表达重组黑曲霉果胶酶的方法。用该方法制备的上清中重组果胶酶达0.62mg/ml，发酵酶活力高达200U/ml，能高效降果胶产生高纯度的果胶寡糖，SDS-PAGE检测分泌酶的纯度达到90％。本发明制备的重组果胶酶具有潜在的工业应用价值，可广泛应用于食品、药品、生物质转化等领域。

背景技术

果胶分子是由不同酯化度的半乳糖醛酸以α-1,4糖苷键聚合而成的多糖链, 常带有鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、海藻糖、芹菜糖等组成的侧链,游离的羧基部分或全部与钙、钾、钠离子,特别是与硼化合物结合在一起.它存在于所有的高等植物中,沉积于初生细胞壁和细胞间层,在初生壁中与不同含量的纤维素、半纤维素、木质素的微纤丝以及某些伸展蛋白(extensin)相互交联,使各种细胞组织结构坚硬,表现出固有的形态.果胶分子的结构因植物的种类、组织部位、生长条件等的不同而不同,其大致的结构可分为光滑区(smooth region)和须状区(hairy region)两部分,主要由HGA、RG-Ⅰ和RG-Ⅱ三个结构区域构成,其中RG-Ⅱ常以二聚体的形式存在.同其它植物多糖一样,果胶也是多分子的、多分散的、多结构的、有高级空间构象的,也具有一定的相对分子质量分布.

果胶由于其不溶性，不能被人类很好利用，它必须通过果胶酶(pectolyticenzyme or pectinase)降解成水溶性寡糖。果胶酶是指能够分解果胶物质的多种酶的总称.许多霉菌及少量的细菌和酵母菌都可产生果胶酶,主要以曲霉和杆菌为主. 新近报道的其它菌有青霉如意大利青霉(Penicillium itaticum)、扩展青霉 (Penicilliumexpansum)以及Penicilliumgriseoroseum等,白绢菌(Sclerotium rolfsii)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、微小毛霉(Mucorpusilus)、高大毛霉(Mucor mucedo)、热解糖梭菌(Cloctridium thermosaccharolyticum)、匐枝根霉(Rhizopus stolonifer)、出芽短梗霉(Aureobasidu-im pullulans)、粗糙链孢霉(Neurospora rassa) 嗜热侧孢霉(Sporotrichum thermophile)]等.由于真菌中的黑曲霉(Aspergillus niger) 属于公认安全级(GRAS,General Regarded As Safe),其代谢产物是安全的,因此目前市售的食品级果胶酶主要来源于黑曲霉,最适pH值一般在酸性范围.

果胶酶大致分为果胶水解酶(pectin hydrolas-es)、果胶裂解酶(pentinlyases, PL)、果胶酯酶(pectin esterases,PE)和原果胶酶等,其中果胶水解酶又可分为聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonas-es,PG)、聚半乳糖醛酸甲酯水解酶 (polymethylga-lacturonases,PMG)、聚鼠李半乳糖醛酸酶(rham-nogalacturonases, RHG)、阿拉伯聚糖酶、半乳聚糖酶、木糖基半乳糖醛酸酶(xylogalacturonase)等, 由于人们对PG的认识最早、应用最广泛,因此早先常被称为果胶酶(pectinase).为避免发生概念混淆,国际上常用Pectolytic Enzyme来代替Pectinase.PMG水解高酯化果胶分子的α-1,4糖苷键,而PG则通过水解作用切断果胶酸分子的α-1,4糖苷键,后者对果胶的水解速度及程度随果胶酸酯化程度的增加而降低,与PE协同作用可加速降解。