[发明专利]检测白血病NUP98系列融合基因寡核苷酸、检测方法和试剂盒

说明书

本发明是一种用于检测白血病NUP98系列融合基因引物、试剂盒及检测方法，包括红细胞裂解液、TRIzol、氯仿、无水乙醇、ReverTra Ace qPCR RT Kit、检测体系PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品。利用实时荧光PCR中的Taqman探针技术检测患者体内NUP98/HOXD11、NUP98/HOXD13、NUP98‑KDM5A、NUP98/HOXA11、NUP98/HOXA9和NUP98‑NSD16种融合基因的表达情况以及对高危人群进行较为准确的筛查和鉴定，具有特异性好，灵敏度高，方法简便高效的特点。

技术领域

本发明属生命科学和生物技术领域，具体涉及一种检测白血病NUP98系列融合基因检测试剂盒。

背景技术

核孔复合物(nucleoporin gene,NPC)贯穿于核膜，作为细胞核与细胞质物质交换的惟一通道，在细胞正常的生长与分化中发挥着重要作用。研究表明核孔蛋白的结构和功能异常会引发多种人类疾病，其中因染色体易位产生的核孔蛋白NUP98系列融合基因已被证实和多种白血病关系密切。

在易位产生的融合基因中，较为普遍的是NUP98与同源框基因(homebox gene,HOX)的异常融合，其中NUP98/HOXA9、NUP98/HOXA11因t(7；11)(p15；p15)易位所致，与人类急性粒细胞性白血病(acute myelognous leukemia，AML)、慢性粒细胞白血病(chronicmyelocytic leukemia，CML)和骨髓异常增生综合症(myelodysplastic syndromes，MDS)密切相关，而NUP98/HOXD11和NUP98/HOXD11由t(2；11)(q31；p15)易位所致，最终可致AML。由于NUP98/HOX融合基因中，NUP98均断裂于12号内含子或附近，且融合后的HOX羧基端均含HD同源域，这样NUP98/HOX融合基因就保留了NUP98蛋白的N端的FG重复序列和HOX蛋白C端的同源盒结构域。因此各NUP98/HOX融合蛋白有着类似的致病机制，即通过NUP98代替HOX N端的转录抑制区域，利用其N端FG重复序列转录激活一系列HOX应答基因，从而导致HOX靶细胞表达失调，干扰粒细胞的正常终末分化而不断增殖，最终产生白血病表型。此外，研究还发现分别由t(5；11)(q35；p15)与t(11；12)(p15；p13)易位导致的融合基因NUP98/NSD1、NUP98/KDM5A亦可上调HOX基因表达，抑制髓系母细胞分化，引发AML。NUP98系列融合基因在AML中发生率只占1％-2％，在CML以及MDS中发生率更低，但是检测这些融合基因对正确诊断及治疗方案制定具有重要的意义。

实时荧光PCR综合生物学、酶学和荧光化学于一体，从扩增到结果分析均在封闭状态下的PCR反应管中进行，其结果用Ct值表示，与普通PCR比较，具有特异度好，灵敏度高，操作简单，结果更直观等优点，被认为是目前微量融合基因检测的首选方法。实时荧光PCR中常见的方法有SYBR GreenI染料法，双探针杂交法以及Taqman技术等。其中SYBR GreenI由于是非饱和染料，特异性不如双探针杂交法以及Taqman法，必须通过观察溶解曲线来判断其特异性，而双探针法杂交法成本又较为昂贵。因此本试剂盒采用实时荧光PCR结合Taqman探针检测NUP98系列融合基因。

发明内容

为解决上述问题，本发明设计了检测内参/目的基因用引物、探针，采用实时荧光PCR技术，检测内参基因ABL、NUP98系列融合基因的表达情况。试剂盒通过调整内参/目的基因的引物探针比例，以及PCR反应条件，使扩增效率和速率均达到最佳。

用于NUP98系列融合基因的检验试剂盒中包括检测用引物、荧光探针、cDNA第一链合成试剂、实时荧光PCR混合液、阴性对照和阳性对照，其特征在于：