[发明专利]一种微量精子冷冻保存方法

权利要求书

1.一种微量精子冷冻保存方法，其特征在于，依次包括如下步骤：

(1)精子冷冻保存载体制备

①配制质量浓度为1.5％的海藻酸钠和3％果胶的混合溶液10ml，采用静电液滴法将海藻酸钠溶液滴入质量浓度为1.1％的氯化钙溶液中形成海藻酸钙水凝胶微球，钙化30min后用去离子水清洗水凝胶微球去除微球表面的氯化钙溶液；

②将清洗干净的微球加入到质量浓度为0.05％的聚赖氨酸溶液中进行成膜反应，搅拌条件下反应30min后形成微球外壳，去离子水清洗微球去除聚赖氨酸溶液；

③将清洗干净的微球加入到质量浓度为1.4％的柠檬酸钠溶液液化30min，完全液化内部凝胶形成中空结构，去离子水清洗微球去除柠檬酸钠溶液，即得中空微球载体；

(2)精子冷冻保存

冷冻时，先吸取20个精子于精子培养皿中，然后吸取5个中空微球载体于精子培养皿中，用卵泡内单精子注射针抓取4个活动精子置入1个冷冻保存载体中，用吸管吸取5个冷冻保存载体放入1.8mL的冷冻管，冷冻管内添加1ml精子冻存液，液氮面上方4cm高度的液氮蒸汽预冷降温5min，降温速度10℃/min，待温度降到-20℃后，将冷冻管投入液氮中进行快速冷冻。

2.按照权利要求1所述的微量精子冷冻保存方法，其特征在于：精子解冻复苏时，自液氮罐中取出冷冻管，用吸管将冷冻保存载体从冷冻管内取出，迅速加入到37℃精子培养皿中，倒置100-200倍放大倍数的显微镜下在冷冻载体内仔细寻找精子，用卵泡内单精子注射针抓取精子转入精子培养皿的精子培养基中，用于后续精子制动和成熟卵子的ICSI。