[发明专利]一种金边土鳖快速鉴别方法

权利要求书

1.一种金边土鳖快速鉴别方法，其特征在于：通过针对金边土鳖的特征引物的聚合酶链式反应，对金边土鳖进行快速鉴别；

其包括以下步骤：

步骤一、将收集的各批供试药材分别取总DNA；

步骤二、取特征引物P3，P4加无菌水稀释；

步骤三、通过PCR反应程序获得扩增产物；

步骤四、扩增产物与6×Loading buffer混匀后点于琼脂糖凝胶上，置于紫外灯下观察，拍照并保存；

步骤五、照片中显示正品金边土鳖在250 bp~500bp之间有一条清晰条带，其他混淆品在该位置均无条带，阴性无干扰；

所述步骤二中，取特征引物P3 5'-CTGGCTGAGGGTCG-3'，P4 5'-ATCTGGGGGGTATG-3'加无菌水稀释成10μmol/μL，备用。

2. 根据权利要求1所述的金边土鳖快速鉴别方法，其特征在于，所述步骤一中，将各批供试药材，经75%乙醇擦拭表面，晾干，用研钵研磨成粉末，取研碎后的粉末25mg，用DNeasyBlood ＆Tissue Kit提取试剂盒提取试剂盒提取总DNA，备用。

3. 根据权利要求1所述的金边土鳖快速鉴别方法，其特征在于，所述步骤三中，PCR扩增：50μl体系中含有浓度为10μmol的P3、P4上下游引物各1μL，模板DNA 2μL，Prime STAR HS(Premix)聚合酶预混体系25μL，剩余体积用无菌蒸馏水补足。

4. 根据权利要求1所述的金边土鳖快速鉴别方法，其特征在于，所述步骤四中，取扩增产物5μL，与6×Loading buffer 1.0μL混匀后点于0.75%琼脂糖凝胶上，用1×TAE电泳缓冲液在90V电压恒压电泳30min；取出凝胶，置于紫外灯下观察，并用CAMAG成像系统拍照并保存。

5. 根据权利要求1或3所述的金边土鳖快速鉴别方法，其特征在于，PCR反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，61℃退火15 s，72℃延伸45 s，35个循环；72℃延伸10 min；获得扩增产物。

6.根据权利要求1所述的金边土鳖快速鉴别方法，其特征在于，其还包括以下步骤：

步骤六、对步骤一至步骤五进行耐用性考察，分别考察方法的重复性和DNA聚合酶对该金边土鳖快速鉴别方法的影响，分别取同一批样品重复进行6次试验、更换DNA聚合酶为Taq聚合酶。

7. 根据权利要求6所述的金边土鳖快速鉴别方法，其特征在于，所述步骤六中， Taq聚合酶PCR体系：50 μL体系中含有浓度为10 μmol的P3、P4上下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL，Taq聚合酶预混体系25 μL，剩余体积用无菌蒸馏水补足。

8. 根据权利要求6所述的金边土鳖快速鉴别方法，其特征在于，PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸10 min；PCR扩增反应在ABI Veriti 梯度PCR仪上进行；PCR完成后，取5 μL产物进行电泳检测，电泳条件为电压90V，电泳时间30min。