[发明专利]一种叶酸修饰的果胶纳米粒子的双靶向递送方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种天然果胶作为药物载体制备新型抗癌药剂的方法，具体一种叶酸修饰的果胶纳米粒子的双靶向递送方法，属于高分子材料应用、先进纳米技术和生物制药领域。

背景技术

果胶广泛存在于植物的果实、根、茎、叶中，是细胞壁的组成成分，构成相邻细胞中间层粘结物，使植物组织细胞紧紧黏结在一起。果胶是线形的多糖聚合物，主要由半乳糖醛酸组成，含有数百至约1000个脱水半乳糖醛酸残基，其相应的平均相对分子质量为50000～150000，主要应用于食品加工行业，如胶凝剂、乳化剂和增稠剂等。果胶良好的生物活性和生物相容性，成为药物载体的新宠儿，近几年研究人员发现果胶的半乳糖凝集素-3(Gal-3)配体具有识别干预肿瘤生长作用，且在胃肠道不能被消化，而结肠分泌的果胶酶可以降解果胶，实现了结肠靶向，同时研究发现果胶可靶向肝癌，诱导细胞凋亡，抑制细胞转移的作用，而现有关于果胶作为药物载体的报道很少，特别是基于靶向果胶载药的报道尚未有报道，因此，建立一种全新的果胶载药系统变得尤为重要，并为今后的研究提供一种新的途径。

发明内容

本发明的目的是提供一种叶酸修饰的果胶纳米粒子的双靶向递送方法，解决疏水药物的溶解性问题，该方法的载体材料生物相容性好、无毒、可生物降解，将果胶设计成双靶向、双载药的果胶纳米粒子实现联合抗癌的功效。

本发明的上述目的通过以下技术方案实现：果胶纳米粒子是由果胶与八臂聚乙二醇共轭结合，果胶与叶酸通过酰胺键连接，八臂聚乙二醇与抗癌药物熊果酸通过酯键结合，得到叶酸-(果胶-多臂聚乙二醇)-熊果酸前药，与抗癌药物羟基喜树碱以一定比例混合，通过自组装的方法制备核壳结构的双靶向纳米粒子。具体步骤如下：

(1)将适量叶酸溶于二甲基亚砜中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)激活叶酸的末端羧基，反应30分钟后加入乙二胺和吡啶，搅拌均匀，避光反应24小时，得到氨基化叶酸(FA-NH2)，将反应液转移到透析膜内，磷酸缓冲溶液(pH＝7.4)作为透析外液，透析过夜，每4小时更换一次透析外液，收集透析膜内溶液，冷冻干燥，得到黄色粉末；

(2)取适量果胶溶于去离子水，搅拌均匀，加入EDC反应30分钟，激活果胶的羧基，再加入FA-NH2和4-二甲氨基吡啶(DMAP)，避光反应24h，将反应液转移到透析膜内，磷酸缓冲溶液(pH＝7.4)作为透析外液，透析过夜，每4小时更换一次透析外液，收集透析膜内溶液，冷冻干燥，得到叶酸-果胶(FA-Pectin)黄色粉末；

(3)取适量八臂聚乙二醇溶于吡啶中，搅拌均匀，加入EDC反应30分钟，激活聚乙二醇的羧基，再加入抗癌药物熊果酸(UA)和催化剂DMAP，连续通氮气，35℃下反应48小时，取出混合液，加入三倍乙醚(v/v，相对于混合液体积)，搅拌均匀，有白色沉淀析出，4000转离心收集沉淀，并用乙醚多次洗涤离心，得到八臂聚乙二醇-熊果酸耦合物粗品，将其转移到透析膜内，磷酸缓冲溶液(pH＝7.4)作为透析外液，透析过夜，每4小时更换一次透析外液，收集透析膜内溶液，冷冻干燥，得到八臂聚乙二醇-熊果酸耦合物(8armPEG-UA)白色粉末；

(4)取八臂聚乙二醇-熊果酸耦合物，EDC溶解在二甲基亚砜中，反应30分钟，加入叶酸-果胶和DMAP，连续通氮气，35℃避光反应48小时，取出混合液，加入三倍乙醚(v/v，相对于混合液体积)搅拌均匀，有黄色沉淀析出，4000转离心收集沉淀，并用乙醚多次洗涤离心，得到叶酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果酸(FA-Pectin-8armPEG-UA)粗品，将其转移到透析膜内，磷酸缓冲溶液(pH＝7.4)作为透析外液，透析过夜，每4小时更换一次透析外液，收集透析膜内溶液，冷冻干燥，得到纯化的叶酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果酸黄色粉末；

(5)二甲基亚砜溶解叶酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果酸耦合物，移液枪析出，逐滴滴入磷酸缓冲溶液中(PBS，pH＝7.4)，搅拌一段时间，得到叶酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果酸纳米粒子溶液，透析，每隔6小时更换透析外液，过夜，收集透析膜内液体，冷冻干燥，得到叶酸-果胶-八臂聚乙二醇-熊果酸纳米粒子黄色粉末；