[发明专利]一种原位测试烟气粒相物诱导血管内皮细胞凋亡的方法

权利要求书

1.一种原位测试烟气粒相物诱导血管内皮细胞凋亡的方法，其特征在于：将捕集的烟气粒相物用DMSO溶解，使用滤膜进行纯化后，对接种了合适密度的并进行过夜培养的人血管内皮细胞进行染毒暴露，利用含有TdT酶和荧光标记物的TdT检测液和PI染色液进行染色，最后用荧光显微镜对细胞凋亡情况进行观察从而在原位分析细胞凋亡的情况；

该方法具体步骤如下：

1）制备烟气粒相物溶液：

a)制备卷烟烟气总粒相物溶液：将卷烟样品使用转盘型吸烟机抽吸，使用剑桥滤片捕集主流烟气总粒相物，DMSO萃取捕集在剑桥滤片上的烟气粒相物组分，滤器过滤后于-80℃保存待用；

b)制备电子烟烟气总粒相物溶液：将电子烟样品使用直线型吸烟机抽吸，使用剑桥滤片捕集主流烟气总粒相物，DMSO萃取捕集在剑桥滤片上的烟气粒相物组分，滤器过滤后于-80 ℃保存待用；

2）人血管内皮细胞培养：将扩增培养好的细胞经胰酶消化以后，制备成细胞悬液，向6孔板中加入一定体积的细胞悬液，于37 ℃、5 % CO2条件下培养过夜；

3）配置实验试剂：（1）细胞培养液，（2）磷酸盐缓冲溶液（PBS），（3）0.05 %的胰酶（4）80%的甘油，（5）PI溶液，（6）阴性对照培养基；

4）烟草制品溶液染毒：用细胞培养液将不同的烟草制品溶液调整到合适浓度，加入到培养过夜的细胞中，进行暴露染毒；

5）样品处理及细胞凋亡检测：细胞染毒24h，PBS漂洗后对细胞进行打孔处理后用含有TdT酶和荧光标记物的TdT检测液对细胞进行染色，避光孵育一定时间后，PBS漂洗并用甘油封片，在荧光显微镜下观察照相；

6）结果分析：

（1）绿色代表TUNEL阳性的细胞，红色代表细胞核；

（2）双阳性的细胞即为发生凋亡的细胞，通过计算双阳性细胞数在细胞总数的比例，即可得出凋亡细胞所占的比例。

2.根据权利要求1所述的原位测试烟气粒相物诱导血管内皮细胞凋亡的方法，其特征在于：各实验试剂的配置方法如下：

（1）细胞培养液：DMEM F12，5%胎牛血清，1%内皮细胞生长因子，100 IU/mL青霉素，100μg/ml 链霉素；

（2）磷酸盐缓冲溶液（PBS）：0.2 g KCl，0.2 g KH2PO4，8 g NaCl，2.9 g Na2HPO4•12H2O，加双蒸水至1 L，pH 7.2~7.4，高压灭菌；

（3）将0.5 g胰酶定容至1000 mL PBS中，冰浴下搅拌3 h~4 h，滤膜过滤，分装到10 mL离心管，于- 20℃ 冻存；

（4）80%的甘油：将8 mL甘油和2 mL无菌水混合，摇动半小时，于4℃ 保存；

（5）PI溶液：将0.5 mg PI溶于500 μL PBS中，终浓度为1 mg/mL，避光4℃保存；

（6）阴性对照培养基：2%（v/v）二甲基亚砜（DMSO）的细胞培养液。