[发明专利]一种烟曲霉唑类耐药的分子生物学快速检测方法

说明书

本发明公开了一种烟曲霉唑类耐药的分子生物学快速检测方法，采集临床标本，用真菌微量DNA提取试剂盒提取真菌DNA，使用真菌ITS特异引文进行扩增，将扩增结果进行测序，blast确定标本中真菌种类，如果有烟曲霉，优化TaqMan探针，使用realtime PCR技术检测L98H突变型对应的核酸位点DNA第363‑365bp有无突变。本发明烟曲霉唑类耐药的分子生物学快速检测方法，具有耗时短，敏感性好，准确性高等优势。

技术领域

本发明涉及一种烟曲霉唑类耐药的分子生物学快速检测方法，属于耐药监测领域。

背景技术

曲霉是最常见的环境真菌，多感染免疫缺陷人群引起肺、鼻窦和脑曲霉病，治疗困难且病死率高。一项北美对960例侵袭性曲霉病的研究发现，主要为血液肿瘤、器官移植和造血干细胞移植患者并发肺部感染，12周内病死率高达45.6％。我国的数据提示侵袭性曲霉病在血液干细胞移植患者发病率10.8％而病死率60％，肝移植患者发病率4.8％而病死率62.5％，并且侵袭性曲霉病的发病率在逐年增加。

侵袭曲霉病绝大多数由烟曲霉引起，在欧洲达到95％以上。自1997年美国报道了首例伊曲康唑耐药以来，烟曲霉耐药逐渐增加，中国孙毅等也陆续报道了烟曲霉伊曲康唑耐药和联合耐药。英国研究发现烟曲霉唑类耐药比率1997-1998年为0％，2004-2005年为5％，2007年为17％，2008年为14％，2009年为20％，其中2008-2009年78％耐药株为多重耐药。

唑类药物使真菌病治疗有了革命性的突破，不仅仅因为抗菌谱广，还因为相对于两性霉素B药物毒性明显降低。2008年美国感染性疾病协会发表的曲霉病治疗方案中，肺、鼻窦和脑等侵袭性曲霉病首选伏立康唑，其次为两性霉素B及其脂质体、卡泊芬净、泊沙康唑和伊曲康唑。伊曲康唑、伏立康唑和泊沙康唑可口服，故慢性或过敏性曲霉病首选。因此，烟曲霉唑类耐药的临床危害很大，且有逐渐增加的趋势，需要密切关注和积极研究。

国内外的真菌耐药检测还是以传统真菌培养和药敏实验为主，耗时长，敏感性差。

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述缺陷，本发明提供一种烟曲霉唑类耐药的分子生物学快速检测方法。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种烟曲霉唑类耐药的分子生物学快速检测方法，采集临床标本，用真菌微量DNA提取试剂盒提取真菌DNA，使用真菌ITS特异引文进行扩增，将扩增结果进行测序，blast确定标本中真菌种类，如果有烟曲霉，优化TaqMan探针，使用realtime PCR技术检测L98H突变型对应的核酸位点DNA第363-365bp有无突变。

为了提高检测准确性，优选，步骤1)中，真菌微量DNA提取试剂盒为Qiagen真菌微量DNA提取试剂盒。

设计特异性引物，对我国临床最为常见的烟曲霉唑类耐药突变TR34/L98H和

TR34/L98H/S297T/F495I进行快速的分子生物学检测。由于我国cyp51A基因突变尤其以L98H型突变最为常见，该突变导致高度的伊曲康唑MIC＞16mg/L)、伏立康唑和泊沙康唑耐药。L98H突变型对应的核酸位点为DNA第363-365bp，是一个SNIP位点，可以有2种以上的基因型。

本发明未提及的技术均参照现有技术。

本发明烟曲霉唑类耐药的分子生物学快速检测方法，具有耗时短，敏感性好，准确性高等优势。

附图说明

图1为现有技术及本申请检测方法对照示意图。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。