[发明专利]DNA单分子测序方法与测序系统

说明书

本发明提供了一种DNA单分子测序方法与测序系统，所述DNA单分子测序方法包括如下步骤：S1对基体表面进行修饰，将水溶性双功能连接单元连接于基体表面；然后将引物P1与水溶性双功能连接单元连接，即得固定有引物的基体；S2、将含待测DNA模板、聚合酶、四色荧光标记可逆终止剂的混合溶液置于固定有引物P1的基体上，进行延伸，形成含荧光素的引物/模板复合物；S3、对延伸后的引物/模板复合物进行成像，确定参与延伸的核苷酸碱基种类；S4、将参与延伸的核苷酸的可裂解连接单元断裂，进行下一次延伸；S5、重复上述步骤S2至步骤S4，获得待测DNA模板的碱基序列。本发明能够完美地做到一次测序循环只延伸一个可逆终止剂的效果。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，涉及一种DNA单分子测序方法与测序系统。

背景技术

人类基因组计划完成后，DNA测序技术得到了迅速发展。DNA测序(DNAsequencing)是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)的排列顺序。发展精确、高通量、低成本的DNA测序方法对于生物、医学等具有重要意义。

DNA合成测序二代测序技术已经得到广泛应用，但是其内在的局限性也是显而易见的。比如测序时间长、DNA扩增可能引入一定的错误率，定量测量相对复杂等。因此，基于单分子的三代测序技术近年来得到了高度重视和发展，以弥补现行的二代测序技术的局限。

目前，单分子测序技术主要基于两种不同的原理。一个是通过DNA分子直接穿过适当的纳米孔而读取DNA分子中的碱基信息(Oxford Nanopore)。另一个是通过合成延伸，结合单分子荧光测量来获取DNA分子中的碱基信息(Helicos与PacificBio)。虽然通过5′-标记荧光技术(PacificBio)可以实现较长的一次性读取，但其检测方式复杂，准确度有所不足。通过碱基的合理荧光修饰，结合单碱基延伸与复活，具有较高的准确性。读取系统相对简单，可充分利用半导体技术的跳跃式发展，实现高通量、低成本的单分子直接测序而不需通过放大等步骤。而这样方法的关键是实现稳定可靠的单碱基延伸以及检测后的长期循环延伸，从而实现准确和较长的序列读取。因此，发展基于这一原理的单分子测序技术具有尤其独特的优势，对临床检测和基础研究都具有现实意义和重要性。

目前文献已经公开的单分子测序方法，最引人注目的是，文献(Nat.Methods2009，6,593-595.)报道的Virtual terminator nucleotides for next-generation DNAsequencing，在该文献中，为了在单分子测序中实现一次测序循环只能延伸一个可逆终止剂的目的，设计合成了结构非常复杂的虚拟终止剂，而这样的结构导致在聚合酶作用下，延伸反应很慢，并且延伸的错误率较高。而在此之前，文献(Science,2008,320,106-109.)报道一次测序循环可延伸一个、两个甚至三个二硫键可逆终止剂，但不能做到一次测序循环只能延伸一个可逆终止剂。

在单分子测序测序中，通过可连接单元将荧光素与核苷酸连接起来形成的可逆终止剂，其电子效应与空间位阻在DNA延伸、断裂可连接连接单元以便除去荧光素等过程中发挥着极为重要的作用，直接影响甚至决定测序的效率、读长等关键指标。基于二硫键连接单元的可逆终止剂在单分子测序中已得到应用，然而文献(Nucleic Acids Research,2008,36,No.4e25)报道基于二硫键的可逆终止剂为单色荧光标记四个不同碱基的核苷酸，Helicos公司为了确保二硫键可逆终止剂作为单分子测序试剂一次只延伸一个可逆终止剂，在荧光素旁边又连接了一个位阻很大的核苷一磷酸以及二膦酸，空间位阻如此大的可逆终止剂的确能够做到一次只延伸一个，然而其合成路线极为繁杂，过大的位阻同时也造成参与DNA链延伸时酶不好识别且速度慢、错配率高(Michael L.Metzker；Nature ReviewsGenetics 2010,11,31.)。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种DNA单分子测序系统与测序方法。本发明提供的测序系统与方法也适用于任何DNA、RNA和基因组测序。