[发明专利]一种利用流式细胞仪进行细胞单克隆化的方法

说明书

本发明公开一种利用流式细胞仪进行细胞单克隆化的方法，包括：步骤一、细胞分选：使用清洁后的流式细胞仪进行细胞分选，利用FSC和SSC的信号进行细胞粘连体去除，孔板中每孔分选1个目标细胞。步骤三、细胞培养：将分选后的目标细胞在二氧化碳培养箱静置培养，培养条件为36.5℃和5～6％CO2，培养5～15天，待克隆恢复。采用本发明的方法，单克隆率达到99.5％。

技术领域

本发明属于生物制药和生物技术领域，具体涉及一种利用流式细胞仪进行细胞分选、单克隆化以及生产用细胞株的构建的方法。

背景技术

生物制药是指综合利用微生物学、化学、生物化学、生物技术、药学等科学的原理和方法制造的一类用于预防、治疗和诊断的制品，以单克隆抗体、重组蛋白、酶、疫苗为主要代表。单克隆抗体等生物药的生产通常借助于哺乳动物表达系统(如CHO，即中国仓鼠卵巢细胞)，即将单克隆抗体的表达载体转染到哺乳动物宿主细胞系中，筛选稳定高效表达目标产物的细胞株。

生产用稳定细胞株的构建通常包括以下步骤，(1)转染，即将目的蛋白的表达载体通过脂质体或者电穿孔的方法转染到宿主细胞中，表达载体上除目的基因序列外，还含有抗生素或者代谢相关的筛选基因；(2)筛选，即使用抗生素等对转染后的细胞进行加压筛选，理论上只有表达目的蛋白的细胞才能存活下来；(3)单克隆化，筛选完成后得到的细胞群需进行单克隆化，对于每一个单克隆细胞株，所有的细胞均来源于同一个母细胞。(4)克隆筛选，得到众多单克隆细胞株后，需评估其表达量、产品质量、细胞株稳定性、反应器可放大性等，最终选出一个用于生产的稳定细胞株。细胞单克隆化是稳定细胞株构建过程中的关键步骤。单克隆化的过程，一方面需要高效地筛选出表达量高的克隆，另一方面需要保证单克隆率达到足够高的水平。目前，监管部门为了保证生物药品的安全性，对生产用稳定细胞株的单克隆性有着严格的要求。

细胞单克隆化的常用的方法包括有限稀释法、半固体培养基铺板、流式细胞仪分选等。有限稀释法是最为传统的方法，通常的操作方法是将细胞梯度稀释，以很低的密度(一般为0.3～0.8细胞/孔)接种到96孔板中(或384孔板)。目前，借助于成像仪器，一轮有限稀释即可到达较高的单克隆率。在有限稀释实验中，细胞在96孔板中满足泊松分布。当铺板密度很低时，存在大量的空孔以及非单克隆孔，同时考虑到细胞的恢复情况，最终每块96孔板可供选择的生长良好的单克隆孔比较有限。因此，有限稀释法是一种效率较低的单克隆化方式，比较耗时耗力。半固体培养基铺板，是将细胞接种到半固体培养基中，生长数天后，单个细胞形成一个群落。如果在半固体培养基中预先加入识别目标产物的荧光标记的抗体，借助于ClonePix等仪器，可以有效地挑选出表达量高的克隆。然而，半固体培养基铺板通常至少需要两轮实验才可以达到足够高的单克隆率，因此增加了时间和经济成本。

流式细胞仪单细胞分选是一种高效的单克隆化的手段，它是通过借助于细胞内的荧光标记，或者对细胞分泌产物进行荧光染色，来分选出表达量高的克隆。使用流式细胞仪将单细胞分选至96孔板，相对于有限稀释法，空孔率大大降低，同时单克隆率得到提升。目前，流式细胞仪单细胞分选技术在稳定细胞株构建过程中已经得到了广泛的应用。由于监管部门对于细胞株单克隆性有着严格的要求，因此在实际应用中，需要优化并验证流式细胞仪分选的单克隆率。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，提供一种利用流式细胞仪进行细胞单克隆化的方法，能够解决现有技术中单克隆率不高的问题。为解决上述技术问题，本发明提供一种利用流式细胞仪进行细胞单克隆化的方法，包括步骤：

步骤一、细胞分选：使用清洁后的流式细胞仪进行细胞分选，利用FSC和SSC的信号进行细胞粘连体去除，孔板中每孔分选1个细胞。

步骤二、细胞培养：将分选后的目标细胞在二氧化碳培养箱静置培养，培养条件为36.5℃和5～6％CO2，培养5～15天，待克隆恢复。