[发明专利]一种肌腱修复材料的制备方法

权利要求书

1.一种肌腱修复材料的制备方法，具体步骤如下：

（1）制备脱细胞跟腱：无菌条件下取新鲜的动物跟腱，用手术剪除去跟腱上的脂肪碎片和其他杂质，用PBS缓冲液漂洗血迹等污垢，再用过氧乙酸溶液进行浸泡消毒处理，将处理后的跟腱组织进行冷冻后，再用匀浆机将其粉粹，依次用含胰蛋白酶、EDTA、TBP、核酸酶的PBS缓冲溶液对粉碎后的跟腱材料进行萃取，脱除细胞成分，调节pH至人体体液pH值，并采用PBS缓冲液清洗，经上述处理后的跟腱材料置于PBS缓冲液中进行4℃保存；

（2）制备肌腱种子细胞：无菌条件下收集患者自身在清创手术中被清除的残碎肌腱组织，剥离外膜后用Hanks液漂洗血迹等污垢，再用过氧乙酸溶液进行浸泡消毒处理，用手术剪将其剪碎成5-6mm³大小的组织块，用胰蛋白酶及胶原酶37℃消化处理，过滤后离心，将组织块均匀悬置于含血小板血浆的DMEM/F12培养液中进行低氧培养，定期更换培养液，当融合成单层细胞后进行传代，将原代细胞消化后置换新的培养液，待80%细胞融合后进行细胞计数，以1×10⁶/ml的细胞浓度接种于培养瓶中进行低氧传代培养；

（3）体外构建组织工程肌腱修复材料：将步骤（1）制备的去细胞异种跟腱材料充分浸入到步骤（2）培养扩增的自体肌腱细胞悬液中，置于37℃培养箱中进行低氧培养、融合，然后在含有外源性生长因子的诱导液中进行诱导培养，定期更换一次复合诱导液，经过数天完成诱导过程，即为可用于移植修复肌腱损伤的肌腱修复材料。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述动物指脊椎动物，鉴于低排斥优选的是哺乳动物，鉴于可用性更优选的是来自哺乳动物的家畜或人，鉴于稳定的可用性，来自猪和人的肌腱组织是优选的。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述的冷冻温度优选为-80℃至-10℃，更优选-60℃至-20℃，最优选-45℃至-30℃，冷冻时间优选为6-10小时。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述的胰蛋白酶的浓度为0.1-0.2 wt%，萃取时间优选为1-2h；EDTA的浓度为0.1-0.2 wt%，萃取时间优选为1-2h；TBP的浓度为1-2wt%，萃取时间优选为3-4h；所述的核酸酶包括DNase I和RNase I，其浓度均为100-200µg/ml，处理时间为1-2h。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述的血小板血浆的浓度为0.5×10⁶-1×10⁶plt/µl。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述的胶原酶的浓度为0.08-0.1%，消化处理的时间为1-1.5h；胰蛋白酶浓度为0.2-0.25%，消化处理的时间为1-1.5h。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）或步骤（2）所述消毒用过氧乙酸的质量浓度为0.1%-0.6%，浸泡处理的时间为0.5-2h。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）所述的体外构建组织工程肌腱修复材料时所用的自体肌腱细胞的浓度为1×10⁵-2×10⁵/ml。

9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）所述的外源性生长因子包括类胰岛素生长因子（IGF）、转化生长因子-β（TGF-β）、血小板源性生长因子（PDGF）、表皮生长因子（EGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、血管内皮生长因子（VEGF）其中的任意两种或者多种组合，总生长因子浓度为0.02-0.2ug/ml。

10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）或步骤（3）所述的低氧指O₂浓度为2-10%。