[发明专利]一种线性多泛素基因的连接方法有效

专利信息
申请号: 201711284310.0 申请日: 2017-12-07
公开(公告)号: CN108315339B 公开(公告)日: 2021-09-07
发明(设计)人: 艾永兴;周宏达;许家翠;吕岩;周小露;吴山力;王铁东;于浩;王梦云;王梦涵;周文杰 申请(专利权)人: 吉林大学
主分类号: C12N15/62 分类号: C12N15/62;C12N15/11;C12N15/70
代理公司: 吉林长春新纪元专利代理有限责任公司 22100 代理人: 陈宏伟
地址: 130011 吉*** 国省代码: 吉林;22
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摘要:
搜索关键词: 一种 线性 多泛素 基因 连接 方法
【说明书】:

发明提供一种连接多泛素基因的方法,提供了优化的泛素(ubiquitin、Ub)基因作为多泛素基因连接的基本单位,用于表达载体的构建,同时本方法利用泛素基因的3’端核苷酸序列的特殊性来设计特殊的平末端酶切位点,并通过平末端限制性核酸内切酶stuI的特殊性将泛素基因连接成一个串联基因。线性多泛素分子可作为细胞内修饰靶蛋白并参与免疫调节的蛋白因子,具有非常广阔的研究及应用前景。本发明中涉及的多泛素基因的连接方法能够快速制备出所需长度泛素的基因,具有工艺简单、安全无毒,成本低等优点。

技术领域

本发明提供一种线性多泛素基因的连接方法,适用于构建多个泛素基因的原核表达载体的方法,可以表达出具有不同数量的泛素的蛋白分子,作为研究多泛素分子的基础,属于生物工程技术领域。

背景技术

泛素(ubiquitin、Ub)是一种广泛存在于真核细胞中的小分子蛋白质,它的分子量约为8.5kDa,其作用为结合与靶蛋白分子上并促进其于蛋白酶体结合促进靶蛋白的降解。多研究表明蛋白质的泛素化与去泛素化与细胞的多种生理进程有重要的关系。

目前用于研究去泛素化酶活性的底物主要是泛素类底物以及类泛素类底物。

泛素在细胞中多以多个泛素连接成串的方式存在,其中比例最多的为Ub4。

连接多泛素基因表达载体,可以用于制备具有不同个数泛素的融合蛋白,具有检测去泛素化酶的活性,筛选不同活力的去泛素化酶 ,研究泛素化过程在细胞中多种生理功能中的具体过程等多种用途。

目前获得多泛素基因的方式主要以生物公司直接合成为主,成本较高,且种类单一。因为单独用平末端限制性核酸内切酶进行线性多泛素连接时,会产生序列顺序颠倒的多泛素基因,而使用双黏性限制性核酸内切酶进行连接时,前后两个泛素的黏性末端无法匹配,因此除本发明外,并不存在人工将单泛素基因逐个连接,形成不同个数的泛素表达基因的方法。

发明内容:

本发明提供一种线性多泛素基因的连接方法,优化的泛素基因可作为多构泛素基因的基本单位;

本发明进一步提供泛素基因连接单位的获取方法;

本发明一种线性多泛素基因的连接方法,包括以下步骤;

1)设计优化单泛素基因序列;

根据泛素的氨基酸序列与大肠杆菌密码子偏好性,设计优化单泛素基因序列的密码子频率、GC含量、mRNA二级结构、重复序列、酶切位点等性质,并去除终止密码子;

设计单泛素基因的3’ 端末位三个碱基为GGC,作为stu I识别位点的前三个碱基,在此序列的3’ 端添加stu I识别位点的后三个碱基 ( CTA ),即为stu I的识别位点,并于此位点后添加一段编码柔性氨基酸的碱基序列和Hind III酶切位点以便于后续的连接以及蛋白纯化;

2)优化的单泛素基因连接单位的获取:

以优化单泛素基因序列为模板设计引物,利用设计的引物运用PCR的方法扩增出所需的单泛素基因连接单位Ub-linker与c-Ub-linker;

3)单泛素基因连接单位与原核表达载体的初步连接;

PET22b原核表达载体、Ub-linker进行双酶切(NdeⅠ、Hind Ⅲ)后,利用T4 DNA连接酶进行连接,获得连接成功的线性单泛素基因;

4)线性多泛素与原核表达质粒的连接方法:

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