[发明专利]粉棒束孢特异性检测试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.粉棒束孢特异性检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括Tar-1F/Tar-1R引物对，所述Tar-1F/Tar-1R引物对序列如SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.42所示。

2.根据权利要求1所述粉棒束孢特异性检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括ITS5-172/ITS4-95引物对，所述ITS5-172/ITS4-95引物对序列如SEQ ID NO.43和SEQ IDNO.44所示。

3.根据权利要求1或2所述粉棒束孢特异性检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括DNA聚合酶和ddH₂O。

4.利用权利要求1~3任一项所述试剂盒检测土壤样本中粉棒束孢污染的方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）提取土壤样品中总核酸；

（2）以步骤（1）提取的总核酸为模板，SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.42所示序列为引物进行PCR扩增，若结果为阳性，再将提取的总核酸用SEQ ID NO.43和SEQ ID NO.44所示序列为引物进行PCR扩增，扩增结果为阳性表明样本中含有粉棒束孢。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，提取土壤样品中总核酸方法如下：

1）取土壤样品，加石英砂充分研磨；

2）向研磨样品中加入清洗液，震荡，离心，收集沉淀；重复2次，再加入PBS缓冲液洗涤；所述清洗液各组分浓度如下：6 g/L三羟甲基氨基甲烷，5.8 g/L EDTA，5.8 g/L NaCl，10g/L交联聚维酮，pH=8.5；

3）向经步骤2）处理的样品中加入裂解液，溶菌酶，蛋白酶K，振荡，充分裂解，离心，收集上清；所述裂解液各组分浓度如下：100mmol pH=8.0的Tris-HCl，100mmol pH=8.0的EDTA，100mmol Na₃PO₄，1.5mol NaCl，50g 聚乙烯吡咯烷酮，10g CTAB，pH=8.0，加水定容至1L；

4）加入与上清液等体积的酚/氯仿/异戊醇，混匀，离心收集上清；

5）加入相当于上清液0.1倍体积的浓度为3 mol/L的 NaAc，再加入相当于上清液0.6倍体积的异丙醇，4℃沉淀，离心，用体积分数70%的乙醇洗涤，离心，沉淀晾干，最后用水溶解即可。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，提取土壤样品中总核酸方法如下：

1）取土壤样品，加石英砂充分研磨；

2）向研磨样品中按重量体积比为0.5：3，单位g/ ml，加入清洗液，震荡5min，18~25℃、12000 rpm离心5 min，收集沉淀，重复2次，加入与清洗液等体积的 PBS缓冲液，洗涤一次；

3）向经步骤2）处理的样品中按清洗液：裂解液：溶菌酶：蛋白酶K体积比为3：5：0.5：0.015分别加入裂解液，浓度为20 mg/mL的溶菌酶和浓度为20 mg/mL的蛋白酶K，振荡10min，37℃水浴30 min，8000 rpm离心10 min，收集上清；

4）上清中加入与上清液等体积的酚/氯仿/异戊醇，颠倒混匀，18~25℃、12000 rpm离心10 min，收集上清；

5）向步骤4）所得上清中加入相当于上清液0.1倍体积的浓度为3 mol/L的 NaAc，再加入相当于上清液体积0.6倍体积的异丙醇，4℃沉淀1 h，12000 rpm离心10 min，用体积分数为70%的乙醇洗涤，12000 rpm离心10 min，晾干，最后用水溶解。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述PCR扩增条件如下：98℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min，最后16℃保存。