[发明专利]一种利用碳基纳米材料提升细菌群落多样性检测准确性的方法

说明书

本发明公开了一种利用碳基纳米材料提升细菌群落多样性检测准确性的方法，包括以下步骤：(1)采集细菌群落样本，提取细菌群落样本的16SrRNA基因，并根据细菌群落样本的16SrRNA基因设计并合成上下游引物；(2)将碳基纳米材料与PCR扩增反应体系混合均匀，并利用上下游引物扩增细菌群落样本的16SrRNA基因；(3)PCR产物分离纯化后，构建文库后进行高通量测序，对测序数据进行处理后，分析嵌合体数量并去除嵌合体序列，然后对非嵌合体序列进行比对，确定错配序列的数量。本发明的碳基纳米材料能够减少细菌群落多样性检测过程嵌合体及错配碱基的产生，从而提升细菌群落多样性检测的准确性。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种利用碳基纳米材料提升细菌群落多样性检测准确性的方法，该方法能够减少细菌群落多样性检测过程中嵌合体及错配碱基的产生，进而提升针对土壤、水体或大气等各种环境中细菌群落检测的准确性。

背景技术

目前对于细菌群落多样性研究一般都遵循采样、提取DNA、扩增16srRNA基因、高通量测序的方法进行。PCR技术即聚合酶链式反应技术，是指在体外选择性扩增DNA片段的技术。每次扩增都以上次扩增的产物作为模板进行指数扩增。PCR技术主要分为三个基本反应步骤，即变性-退火-延伸(Scharf,S.J.,G.T.Horn and H.A.Erlich(1986).DirectCloning and Sequence-Analysis of Enzymatically Amplified Genomic Sequences.Science 233(4768):1076-1078.)。变性阶段双链DNA经过高温变性后解链成单链；退火阶段引物与单链DNA在较低温度下碱基互补配对；延伸阶段引物与模板结合物以脱氧核糖核苷酸(dNTP)为原料，按照半保留复制与碱基互补配对的原则合成一条与模板链互补的新链。不断循环这三个过程即可在短时间内将目的片段扩增数百万倍。目前，PCR技术已经广泛应用于微生物领域的研究。

但是在聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)过程中会产生较多测序错误，如嵌合体和错配序列等等。其中产生嵌合体的原因包括模板的特异性、PCR的循环数、序列的相似性等因素(Lahr,D.J.G.and L.A.Katz(2009).Reducing the impact ofPCR-mediated recombination in molecular evolution and environmental studiesusing a new-generation high-fidelity DNA polymerase.Biotechniques 47(4):857-863；Haas,B.J.,D.Gevers,A.M.Earl,M.Feldgarden,D.V.Ward,G.Giannoukos,D.Ciulla,D.Tabbaa,S.K.Highlander,E.Sodergren,B.Methe,T.Z.DeSantis,J.F.Petrosino,R.Knight,B.W.Birren and H.M.Consortium(2011).Chimeric 16S rRNA sequenceformation and detection in Sanger and 454-pyrosequenced PCR amplicons.Genome Research 21(3):494-504.)。而其中最普遍的原因是模板的不完全扩增，即在PCR过程中两个部分延伸的序列进行结合。在下一轮扩增过程中这种序列也作为模板进行复制，就产生了大量不真实的序列。