[发明专利]特异性识别枣疯植原体的兔抗多克隆抗体的制备方法及其应用试剂盒

说明书

本发明属于枣疯植原体检测领域，尤其涉及特异性识别枣疯植原体的兔抗多克隆抗体的制备方法及其应用试剂盒。本发明所提供的特异性识别枣疯植原体的兔抗多克隆抗体主要应用于枣疯病的检测，其制备方法包括以下有效步骤：a、从感染枣疯植原体的枣树总DNA中克隆获得枣疯植原体的免疫膜蛋白基因序列，预测免疫膜蛋白的氨基酸序列，选取C端表位暴漏性较好的47‑152aa区域进行蛋白表达，进行标签纯化；b、标签纯化后，将选取的蛋白与不完全弗氏佐剂混合免疫大耳白兔，采集兔子血液，经抗原亲和纯化获得枣疯植原体免疫膜蛋白的多克隆抗体。本发明所提供的特异性识别枣疯植原体的兔抗多克隆抗体在枣疯病的检测中，具有显著的特异性，确保了检测的准确性。

技术领域

本发明属于枣疯植原体检测领域，尤其涉及特异性识别枣疯植原体的兔抗多克隆抗体的制备方法及其应用试剂盒。

背景技术

枣树原产于我国，其栽培品种和野生酸枣资源极为丰富，是我国具有重要经济价值的特色果树树种之一。枣疯病是我国枣树上最严重的病害，也是世界上典型的植原体病害之一，其病原为枣疯植原体，属于榆树黄化16SrV-B亚组。

植原体是一类无细胞壁、存在于植物筛管内的病原细菌，主要依靠叶蝉等从韧皮部取食的半翅目昆虫传播，也可由菟丝子和嫁接等传播，因此，植原体膜蛋白可能直接与昆虫或者植物细胞质的某些组分互作，免疫主导膜蛋白是植原体膜蛋白中的重要组分之一。植原体免疫主导膜蛋白承受着较大的选择压力，研究植原体免疫主导膜蛋白的多样性及功能，为进一步阐明植原体致病机制、抗病性鉴定及病害防治奠定基础。

由于枣疯植原体不能离体培养，因而不能采用研究真菌、细菌的传统研究方法进行检测和鉴定。目前，枣疯植原体的检测主要依靠生物学测定(嫁接、症状类型等)、电镜观察、PCR检测技术。传统的症状观察依赖枣树枝叶的症状表现，主要依赖经验诊断，并无具体诊断数据支撑，仅能作为枣疯病植原体鉴定的形态学指标，而不能作为病原检测的主要方法；嫁接检测所需的等待时间过长，待检测结果确定，病害或已发病至中后期，不适用于大田生产的早期快速检测；电镜检查需要对感病组织做超薄切片、专业度高，并且依赖昂贵的电子显微镜检测，无法在农业生产实践中普及；PCR检测技术是一种基于核酸水平的检测技术，设计通用引物和特异性引物，通过PCR扩增检测植原体存在与否，具有较高的准确性和灵敏性，在学术研究、科研院所的实际检测方面起着重要作用，但专业度太高、操作复杂，成本高，检测结果容易受植物组织提取液的影响，假阳性或假阴性结果现象时有发生，另外，PCR技术操作过程繁琐、耗时长，完全依赖于PCR仪器和商业化的试剂，不适于田间的大规模病害检测。

枣树感病后结果量减少，品质下降，通常2-3年内病树丧失产量并全株死亡。枣疯病几乎分布于国内主要枣树栽培区，每年造成死树高达千万株，直接经济损失达数亿元，已严重阻碍我国枣树产业的可持续发展。因此，我们亟需建立一种操作简单、成本低廉的枣疯植原体高效检测方法，方便工作人员田间病害调查快速检测，尤其是便于广大枣农或非专业人士快捷、易操作地发现病原、防止病害传播，保障农业生产的正常进行。

因此，我们亟需建立一种操作简单、成本低廉的枣疯植原体高效检测方法，方便工作人员田间病害调查快速检测，尤其是便于广大枣农或非专业人士快捷、易操作地发现病原、防止病害传播，保障农业生产的正常进行。

发明内容

本发明针对上述的枣疯病检测流程繁琐、检测成本高、检测技术难度大等技术问题，提出一种设计合理、方法简单、操作方便且无需专业知识即可检测出枣疯病的特异性识别枣疯植原体的兔抗多克隆抗体制备方法及其应用试剂盒。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为，本发明首次克隆到枣疯植原体免疫膜蛋白基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明还提供一种基于上述枣疯植原体免疫膜蛋白基因所制备的用于检测枣疯病的特异性识别枣疯植原体的兔抗多克隆抗体，其制备方法包括以下有效步骤：