[发明专利]基于糖苷键质谱可碎裂型化学交联剂的分析方法及应用

权利要求书

1.一种基于糖苷键质谱可碎裂型化学交联剂的分析方法，其特征在于：使用以二糖为骨架的含有两个反应活性基团的交联剂与组成蛋白质复合物的氨基酸残基进行化学交联反应，得到交联蛋白，利用糖苷键和肽键质谱碎裂能量的选择性差异，实现交联试剂和交联肽段肽键的高选择性可控碎裂，从而降低交联肽段的谱图复杂程度并显著缩减数据检索的规模，实现基于化学交联策略的蛋白质复合体的规模化分析，为研究蛋白质的空间结构及蛋白质-蛋白质相互作用网络提供重要的技术支撑；所述交联反应的特征在于：用于鉴定的蛋白质复合物的来源为：细胞蛋白质提取液、胞浆蛋白质提取液、血浆蛋白质提取液、组织蛋白质提取液、单一蛋白质复合物中的一种或二种以上；

所述交联反应的特征在于：用于溶解蛋白质复合物的溶液为浓度为1mM到200mM的HEPES（羟乙基哌嗪乙硫磺酸）缓冲液，pH范围为6.0到9.0；用于溶解交联剂的溶剂为DMSO（二甲基亚砜）、DMF（二甲基甲酰胺）中的一种；发生交联反应的蛋白质复合物的浓度为0.1到100mg/mL；发生交联反应的交联剂的浓度为0.1到50mM；发生交联反应时有机相与水相的体积比为1：1000到10：1；交联反应温度为0到50℃；交联反应时间为2min到48h；所述浓度均为终浓度。

2.根据权利要求1所述的基于糖苷键质谱可碎裂型化学交联剂的分析方法，其特征在于：所使用的以二糖为骨架的交联剂，含有两个能与氨基酸残基发生化学反应形成共价键的反应活性基团。

3.根据权利要求1所述的基于糖苷键质谱可碎裂型化学交联剂的分析方法，其特征在于：所使用的以二糖为骨架的交联剂，含有零个或一个能用于进行富集的功能性基团。

4.根据权利要求2所述基于糖苷键质谱可碎裂型化学交联剂的分析方法，其特征在于：所述交联剂的反应活性基团，包括氨基反应活性基团，巯基反应活性基团，光反应活性基团中相同的一种或不同的两种；所述氨基反应活性基团为N-羟基琥珀酰亚胺酯、亚胺酸酯、碳化二亚胺中的一种或两种以上；巯基反应活性基团为马来酰亚胺；光反应活性基团为芳基叠氮、双吖丙啶、二苯甲酮中的一种或者两种以上。

5.根据权利要求1或3所述基于糖苷键质谱可碎裂型化学交联剂的分析方法，其特征在于：所述交联剂的富集基团，包括直接富集基团和间接富集基团；

所述的直接富集基团为生物素，间接富集基团为：烯基、炔基、叠氮中的一种或者两种以上。

6.根据权利要求5所述的基于糖苷键质谱可碎裂型化学交联剂的分析方法，其特征在于：所述间接富集基团是通过点击化学反应引入直接富集基团，然后进行富集反应。

7.根据权利要求1所述的基于糖苷键质谱可碎裂型化学交联剂的分析方法，其特征在于：所述交联蛋白，经过高温或高浓度盐溶液条件变性、（三(2-羧乙基)膦 盐酸盐）或二硫苏糖醇还原、碘代乙酰胺烷基化及酶解步骤得到肽段样品；

所得到的肽段，若为通过不含有富集功能基团的交联剂反应得到，则应用于通过强阳离子交换、体积排阻色谱的方式对含有蛋白质相互作用信息的交联肽段进行富集；

所得到的肽段，若为含有富集功能基团的交联剂反应得到，则应用于通过富集反应，将含有富集功能基团的肽段富集。

8.根据权利要求7所述的基于糖苷键质谱可碎裂型化学交联剂的分析方法，应用于将经富集得到的肽段样品进行液相色谱联用质谱分析，质谱采集模式为二级质谱或三级质谱；二级质谱采集模式中第二级质谱碎裂模式为CID、ETD、HCD、EThcD中的一种或二种以上联用；三级质谱采集模式中第二级质谱碎裂模式为CID、ETD、HCD、EThcD中的一种或二种以上联用，对具有特征质荷比差异的碎片离子进行三级质谱鉴定或对信号强度从高到低前1到200的碎片离子进行三级质谱鉴定；不同碎裂模式的碎裂能量范围为2%到80%；在采用三级质谱鉴定方式时，二级质谱碎裂模式的碎裂能量选择优先断裂糖苷键的碎裂方式，三级质谱选择适合肽段肽键碎裂的模式和能量。

9.根据权利要求7所述基于糖苷键质谱可碎裂型化学交联剂的分析方法，其特征在于：所述方法使用以二糖为骨架的含有两个反应活性基团的交联剂与蛋白质复合物进行化学交联反应，利用糖苷键和肽键质谱碎裂能量的选择性差异，应用于交联试剂和交联肽段肽键的高选择性可控碎裂，从而降低交联肽段的谱图复杂程度并显著缩减数据检索的规模，应用于基于化学交联策略的蛋白质复合体的规模化分析，研究蛋白质的空间结构、构建蛋白质-蛋白质相互作用网络。