[发明专利]毛细管电泳-连续波长双光子荧光偏振检测装置

说明书

本发明涉及一种毛细管电泳‑连续波长双光子荧光偏振检测装置，主要由毛细管电泳分离单元、可调连续波长双光子荧光激发单元、荧光信号采集转换单元和数据处理单元等四部分组成。其基本工作原理为：在高压电场作用下，荧光物质在毛细管中进行迁移、分离；当其到达检测窗口时，荧光信号被飞秒激光器发射的高强度脉冲激光激发，并经过荧光偏振分光光学器件被分为垂直偏振光和水平偏振光，分别被高灵敏荧光探测器采集。在该装置中，荧光激发限定在飞升级小体积内，可实现对单粒子荧光的分辨与分析；另外，双光子激发产生的荧光偏振可以更为精细地反映生物分子构象和运动状态，为生物分子相互作用等前沿问题的研究提供了先进而有效的技术支撑。

技术领域

本发明涉及一种毛细管电泳-连续波长双光子荧光偏振检测装置，本装置将高效的毛细管电泳分离技术、高灵敏飞升体积双光子激光诱导荧光检测技术和荧光偏振检测技术结合为一体。采用飞秒激光器发射的脉冲激光作为荧光激发光源，实现了电场分离中飞升体积选择性激发，可实现对单颗粒荧光的分辨分析。本装置为化学分析和生物分析提供了先进而有效的技术支撑。

背景技术

毛细管电泳-激光诱导荧光检测是一种将高灵敏荧光检测与高效率微分离相结合的现代先进分析技术，应用范围广，涉及环境科学、医药学、生物学等多个重要学科领域；其分析对象包括小分子药物、核苷、激素、多肽、蛋白质、核苷酸。即使不采用任何分离介质(如凝胶、线性聚合物等)，利用溶质在自由溶液中电迁移的不同也可实现分离。除此之外，毛细管电泳-激光诱导荧光技术还可应用于细胞和亚细胞器的分离分析。

荧光偏振是指当荧光分子受到平面偏振光激发时，荧光分子发射偏振光。荧光偏振响应与分子转动相关，而分子转动又与分子的大小相关。因此，可以简化为：荧光偏振是分子大小的函数；大体积分子转动慢，荧光偏振响应高，小体积分子转动快，荧光偏振响应低。利用这一原理，荧光偏振可应用于荧光免疫分析、生物分子相互作用研究。将毛细管电泳-激光诱导荧光检测与荧光偏振技术相结合，不仅保留了高效、快速分离和高灵敏检测等优点，同时还提供了荧光偏振信息，为研究生物大分子之间的相互作用提供了一种新的分析方法。

在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收两个长波长的光子，这两个光子的能量可以加起来，使得荧光分子的电子跃迁至激发态，其荧光激发效果与短波长单光子激发效果相当。但是相对于传统单光子激发，双光子激发具有光漂白区域小、光毒性小、穿透力强和信噪比高等优点。为了达到很高的光子密度而又不损伤样品，双光子激发需要使用高能量超快脉冲激光器。

本发明在毛细管电泳-激光诱导荧光偏振检测装置的基础上，采用飞秒激光器发射的脉冲激光作为激发光，从而在保留原来装置高效分离、高灵敏检测等优点的基础上，实现了电场分离中飞升小体积选择性激发，可实现对单颗粒荧光的分辨分析。本装置为化学分析和生物分析提供了先进而有效的技术支撑。

发明内容

本发明涉及一种毛细管电泳-连续波长双光子荧光偏振检测装置，主要由毛细管电泳分离单元、双光子荧光激发单元、荧光信号采集转换单元和数据处理单元等四部分组成；其包含飞秒脉冲激光器、导致荧光显微镜、光学聚焦透镜、高压电源、铂电极、缓冲液瓶、石英毛细管、绝缘载物台、荧光偏振分光光学器件、滤光片、高灵敏荧光探测器、光电倍增管、电光调制器、科研级互补金属氧化物半导体相机等关键器件(见附图1)。其基本工作原理为：在高压电场作用下，荧光物质在毛细管中进行迁移、分离，当其到达飞升体积检测窗口时，荧光信号被飞秒激光器发射的高强度脉冲激光激发，并经过光学聚焦透镜和滤光片进入荧光检测系统，荧光偏振分光光学器件将荧光分为垂直偏振光和水平偏振光，分别被两个高灵敏荧光探测器采集，再经过光电倍增管转换为电信号，记录在计算机中以进行后期数据分析处理。