[发明专利]一种基于热击的哈维弧菌同源重组基因敲除的方法

说明书

本发明公开了一种基于热击的哈维弧菌同源重组基因敲除的方法，包括以下步骤：将培养至对数早期的哈维弧菌受体菌热击处理后与培养至对数早期的供体菌进行等体积混匀，室温离心去上清，菌沉淀后重悬，点种至固体平板上，接合过夜，通过对接合受体菌哈维弧菌热击处理，使得哈维弧菌的接合转化效率从无到有，从而对哈维弧菌进行基因敲除。该方法在传统的接合转移法的技术基础上，通过对接合受体菌哈维弧菌热击处理，使得哈维弧菌的接合转化效率从无到有，成功对哈维弧菌进行基因敲除。

技术领域

本发明属于哈维弧菌技术领域，具体涉及一种基于热击的哈维弧菌同源重组基因敲除的方法。

背景技术

哈维弧菌是一种革兰氏阴性、发光呈弯曲短杆菌，具发酵能力，极生单鞭毛。哈维弧菌在海洋中的自由水体、浮游动植物体表、海底沉积物中大量存在，是一种普遍存在于海洋环境中的病原菌，可感染多种鱼、虾、蟹等并造成大量的死亡，给海水养殖业带来巨大的损失。因此，阐明其致病机制并制备相关疫苗，进行免疫防控迫在眉睫。

基因敲除，又称基因打靶，是一种新型的分子生物学技术，该技术利用接合转化，将构建的打靶载体导入靶细胞后，通过重组载体DNA序列和靶细胞内染色体上的同源DNA序列，将载体DNA定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，或与靶细胞基因组上某一确定片段置换，使机体特定的基因失活或缺失，从而改变细胞遗传特性的方法。

致病机制研究通常涉及基因敲除的基因工程操作，而这些方法通常通过基因接合转移法进行。但是，该方法的接合转移效率对于不同种属细菌存在差异。迄今为止，哈维弧菌的接合转移效率一直很低甚至大多数菌株不能成功接合转移，其基因敲除的常规同源重组法常常受到阻碍。

发明内容

本发明针对因哈维弧菌的接合转化不成功或者效率低从而难以进行基因敲除的难题，通过对接合受体菌哈维弧菌进行热击处理，建立一种基于热击的哈维弧菌同源重组基因敲除的方法。

本发明的上述目的是通过如下技术方案实现的：一种基于热击的哈维弧菌同源重组基因敲除的方法，包括以下步骤：将培养至对数早期的哈维弧菌受体菌热击处理后与培养至对数早期的供体菌进行等体积混匀，室温离心去上清，菌沉淀后重悬，点种至固体平板上，接合过夜，通过对接合受体菌哈维弧菌热击处理，使得哈维弧菌的接合转化效率从无到有，从而对哈维弧菌进行基因敲除。

优选的，本发明热击处理时的温度为35～50℃。

进一步的，本发明热击处理时的温度为35～50℃时，热击处理时的时间为10min以上。

优选的，本发明在28℃接合过夜。

本发明所述的供体菌优选为携带有待缺失片段上下游同源臂的重组自杀质粒。

具体的，本发明中的基于热击的哈维弧菌同源重组基因敲除的方法，包括以下步骤：

(1)确定待突变基因X的上下游序列以及自杀质粒插入位点，利用NEB在线软件(http://nebμilder.neb.com/)设计无缝克隆法重组子载体构建引物，得到上游同源臂扩增引物对X-UP-F/R、下游同源臂扩增引物对X-DOWN-F/R，自杀质粒线性化引物对P-F/R，重组子质粒检测引物对P-check-F/R及待突变基因缺失检测引物对X-Del-check-F/R；

(2)提取哈维弧菌基因组为模板，基于引物对X-UP-F/R和X-DOWN-F/R，利用PCR技术获取拟敲除基因长度约为1000bp的上游同源臂片段UP及下游同源臂片段DOWN，琼脂糖电泳检测后切胶回收；

(3)提取自杀质粒为模板，基于引物对P-F/R，利用PCR技术获取长度为3309bp的质粒片段P，琼脂糖电泳检测后切胶回收；