[发明专利]具有自杀基因开关的靶向CD47的工程化免疫细胞

说明书

本发明提供了一种具有自杀基因开关的靶向CD47的工程化免疫细胞。具体地，本发明提供了一种靶向CD47的嵌合抗原受体T细胞，并且所述细胞的CAR结构中包含细胞自杀元件。本发明对CAR结构中的CD47 scFv的亲和力作出了优化并选择合适的CAR‑T细胞输注方式，从而使其对正常组织的毒性降低到人体可接受水平。同时在确保CD47 CAR‑T细胞的活性的基础上，添加细胞自杀元件，用于控制CAR‑T细胞的活性和CRS等相关毒性，增强安全性。

技术领域

本发明涉及免疫治疗领域，具体地涉及具有自杀基因开关的靶向CD47的工程化免疫细胞，更具体地涉及一种靶向CD47的嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用。

背景技术

细胞免疫治疗是一种新兴的、具有显著疗效的肿瘤治疗模式，是一种自身免疫抗癌的新型治疗方法。它是运用生物技术和生物制剂对从病人体内采集的免疫细胞进行体外培养和扩增后回输到病人体内的方法，来激发、增强机体自身免疫功能，从而达到治疗肿瘤的目的。

嵌合免疫抗原受体(Chimeric antigen receptors，CARs)由胞外抗原识别区域，通常是scFv(single-chain variable fragment)，跨膜区以及胞内共刺激信号区域组成。CARs的胞外段可识别一个特异的抗原，随后通过胞内结构域转导该信号，引起T细胞的活化增殖、细胞溶解毒性和分泌细胞因子，进而清除靶细胞。CAR-T细胞治疗在血液恶性肿瘤治疗中取得了非常高的临床反应率，这样的高反应率是以往任何一种治疗手段都无法达到的，在世界各引发了临床研究的热潮。但是在实体肿瘤治疗中，研究人员发现在小鼠中注射meso-cart 能够约束肿瘤的生长，但是不能治疗肿瘤。这可能是由于肿瘤微环境中负调控因子的上调导致cart功能的减退，如在肿瘤微环境中，T细胞表面 PD-1(programmed deathprotein-1)表达上调限制了T细胞的功能。

B细胞淋巴瘤患者的外周血及生发中心样B细胞中CD47的表达水平都明显高于正常B细胞。同时，研究还发现不同病理组织学类型的非霍奇金淋巴瘤(NHL) 中CD47均有表达，如弥漫大B细胞性淋巴瘤(DLBCL)、滤泡细胞性淋巴瘤(FL)、边缘区淋巴瘤(MZL)、套细胞性淋巴瘤(FCL)等。

CD47是治疗肿瘤的一个潜在靶点，目前研究主要集中在使用靶向CD47的抗体来进行肿瘤治疗，CD47抗体治疗是通过DC细胞和CD8+T发挥肿瘤杀伤效应的。DC细胞通过CD47抗体和亲吞噬分子协同作用，吞噬肿瘤细胞，并提呈肿瘤相关抗原给CD8+T，进而发挥CD8+T对肿瘤的特异性杀伤作用。

CD47作为细胞表面分子，在肿瘤细胞上高表达，因此可以设计靶向CD47的免疫嵌合受体T细胞(CAR-T)，对肿瘤进行治疗。在CD47CAR设计过程中，需要平衡CAR对抗原的亲和力，筛选出适当亲和力，CAR对正常组织的杀伤毒性在人体可接受的水平。选择合适的CAR-T细胞输注方式对减弱CD47 CAR-T的毒性会有帮助。

与抗体治疗相比，CAR-T细胞治疗的优势有：抗体的作用只是短暂的，停药后抗体阻断效果就会消失；有效抗体研发困难；抗体药物昂贵；抗体阻断CD47 信号后，肿瘤细胞被吞噬细胞识别杀死，在一些肿瘤负荷较高的病人中，没有足够的吞噬细胞对肿瘤细胞进行吞噬，达不到治疗效果，而CAR-T细胞靶向肿瘤细胞表面CD47分子，被激活后直接对肿瘤细胞进行杀伤，不依赖于其他细胞。

目前，本领域还没有成熟的靶向CD47的CAR-T细胞，本领域迫切需要开发靶向CD47的CAR-T细胞。

发明内容

本发明的目的在于提供具有自杀基因开关的靶向CD47的工程化免疫细胞，更具体地在于提供一种靶向CD47的嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用。

本发明的另一目的在于对CD47 CAR-T的scFv亲和力进行优化，并加入安全开关来控制CD47 CAR-T的毒性。