[发明专利]一种增强型抗肿瘤NK细胞及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种增强型抗肿瘤NK细胞及其制备方法和应用。该抗肿瘤NK细胞为经双重靶向嵌合受体改造的NK细胞；所述的双重靶向嵌合受体由PD‑1胞外段、NKG2D全长段，以及共刺激分子41BB胞内段组成。本发明所述的抗肿瘤NK细胞，采用双重靶向嵌合受体对NK细胞进行改造，能够提高NK细胞的抗肿瘤治疗效果，实现对实体瘤的特异性识别和杀伤，并且不会引起机体过激的免疫应答反应。

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体的说，涉及一种增强型的抗肿瘤NK细胞及其制备方法和应用。

背景技术

近年来，肿瘤免疫细胞治疗因其显著的疗效而在肿瘤治疗中备受瞩目，特别是基于嵌合抗原受体改造的T细胞(CAR-T)，在血液系统恶性肿瘤的临床治疗展现出良好的靶向性、杀伤力和持久性，使之成为肿瘤免疫治疗领域最令人信服的突破。然而，尽管CAR-T技术研发不断取得进步，但依然面临着诸多挑战，主要障碍之一为CAR-T虽然具备强大的杀死癌细胞的能力，但其本身所引起的过强免疫应答反应潜在威胁患者生命。并且无论CAR-T或是TCR-T(T细胞受体嵌合型T细胞)等免疫细胞技术，迄今为止对实体瘤的治疗鲜有奏效，而治疗实体瘤恰是抗肿瘤的真正主战场。因此，如何克服CAR-T技术的弊端以及如何能赋予免疫细胞对实体瘤细胞的精准识别与特异杀伤，成为免疫细胞治疗亟待解决的问题。

NK细胞(自然杀伤细胞)是机体重要的免疫细胞，约占健康人外周血淋巴细胞总数的10％。NK细胞在实体瘤发生发展的早期免疫反应和免疫监视过程中发挥重要作用，为机体抵抗肿瘤的第一道防线，利用NK细胞进行临床治疗已有较长历史。与T细胞相比，NK细胞具有许多自身的免疫特性和优势：一是NK细胞具有不受HLA(人白细胞抗原)限制的非特异性肿瘤细胞杀伤作用，主要通过表面细胞毒受体，触发穿孔素和颗粒酶的释放，产生细胞毒因子和TNF(肿瘤坏死因子)等细胞因子，而不产生IL-2等细胞因子，避免造成致死性细胞因子风暴；二是NK细胞还可通过CD16与抗体Fc片段结合，诱发ADCC(抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用)的特异性杀伤作用；三是NK细胞的杀伤作用具有连续性，可从一个目标移向另一个目标，杀死多达7～10个肿瘤细胞，而T细胞缺乏这种连续杀伤性；四是NK细胞寿命短暂，发挥功效后很快会消失，无需考虑类似CAR-T细胞需要自杀基因来限制其持久副作用。由于这些有利因素，NK细胞用于患者治疗时有效并且安全。

NK细胞免疫监视功能取决于表面抑制性受体和活化性受体所传递信号的整合。NKG2D是NK细胞的主要活化性受体之一，其通过识别相关性配体(NKG2DL)来发挥NK细胞的细胞毒作用。人类NKG2D配体主要有组织相容性复合性I类链相关蛋白A/B(Major Histo-compatibility Complex Class I Chain-related Protein A/B，MICA/B)和人巨细胞病毒UL16结合蛋白(HCMV UL16-binding protein，ULBP)。研究表明，超过90％的人类肿瘤细胞表面上至少会表达一种NKG2DL。NKG2D通过识别肿瘤细胞表面的NKG2DL来传递活化信号并激活免疫系统，从而对肿瘤细胞发挥杀伤作用。然而，NKG2DL的脱落蛋白(简称NKG2DLs)会导致NK细胞的细胞毒性受损，这是由于抗原性NKG2DL的丢失和NKG2DLs诱导了NKG2D的下调。研究表明，多种癌症患者血浆中的NKG2DLs含量与NKG2D依赖性NK细胞的细胞毒性呈负相关。克服NKG2D受体与NKG2DLs的亲和力是NKG2D-NKG2DL系统在机体中能否发挥抗肿瘤免疫效应的关键。