[发明专利]番鸭细小病毒和鹅细小病毒双重实时荧光定量PCR检测引物

说明书

本发明提供一种番鸭细小病毒（MDPV）和鹅细小病毒（GPV）双重实时荧光定量PCR检测引物及方法，其中，MDPV引物序列如下：上游引物P1：TAATGGTGGCAGGAATGCACAGTTC，下游引物P2：TGTTACCATGATGTCTGAAAT；GPV引物序列如下：上游引物P3：GAGGTAGACAGCAACAGAAA，下游引物P4：GCTCGTCCGTGACCATA。目前，还没有基于SYBR Green II的双重实时荧光定量PCR检测引物及方法可以同时将GPV各种基因亚型完全地和MDPV区分开来的相关研究报道和发明专利，本发明的建立可填补相关领域空白。

技术领域

本发明属于预防兽医学领域，涉及番鸭细小病毒（MDPV）和鹅细小病毒（GPV）双重实时荧光定量PCR检测引物及方法，具体涉及用于MDPV和GPV多重SYBR Green II实时荧光定量PCR方法的引物及方法。

背景技术

番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus，MDPV)是引起雏番鸭以腹泻、软脚和呼吸困难为主要症状的雏番鸭疫病（俗称“三周病”）的病原，主要引起3周龄以内雏番鸭发病，发病率为27%～62%，病死率为22%～43%，是危害番鸭养殖的重要病原。该病最早由我国学者程由铨于1988年在世界首次分离鉴定到MDPV，随后法国、美国、日本等地相继报道了本病的流行。

鹅细小病毒（Gosling parvovirus，GPV）也称小鹅瘟病毒，是引起雏鹅和雏番鸭的一种高度接触性、急性败血性传染病（小鹅瘟，Gosling Plague）的病原。该病最早由我国学者方定一于1956年在江苏扬州发病鹅群中发现，并在世界首次分离到GPV。该病发病率和死亡率高，且传播速度快，是对养鹅业产生严重危害的一种重要传染病。近十多年来，GPV出现了新的变异株，如1997年以来在我国番鸭群暴发流行一种新基因亚型MDGPV(代表株GPV PT株)；2015年以来在我国半番鸭、樱桃谷鸭群暴发流行一种以短喙长舌易骨折生长障碍为特征的疫病，其病原为不同于GPV和GPV PT株的新型GPV（称为SBDS-GPV）

MDPV和GPV在分类学上均为细小病毒科依赖病毒属成员。两者在形态结构上难以鉴别，在基因组序列上高度同源。MDPV和GPV基因组核苷酸以及推导氨基酸序列同源性分别为81.9%和88.9%，因而临床鉴别诊断难度较大，普通PCR诊断方法很难鉴别诊断。

SYBR Green II实时荧光定量PCR是在普通PCR的基础上，在扩增反应体系中加入一对特异性引物，使用实时监测的荧光定量PCR检测仪来检测靶核苷酸序列的技术，具有特异性强、灵敏度高、定量准确、适用性广等优点。双重SYBR Green II实时荧光定量PCR是在单重实时荧光定量PCR的基础上，利用2组引物扩增的目的片段其GC含量的差异所导致的Tm值差异，在SYBR Green II实时荧光定量PCR反应完成后结合熔解曲线峰值的差异来对MDPV和GPV进行快速鉴别诊断和病毒载量分析。

目前，尽管针对MDPV和GPV的荧光定量PCR检测方法均有报道，也包括同时可以检测MDPV和GPV的单管双重荧光定量PCR鉴别方法。但由于近年来我国番鸭群中流行的新基因亚型GPV（MDGPV），与经典GPV和MDPV都有较高的同源性，导致用现有的双重荧光定量PCR方法鉴别时往往将它误判为MDPV。目前还没有一套可以同时将GPV各种基因亚型完全地和MDPV区分开来的双重荧光定量PCR检测引物及方法，本发明的建立可填补相关领域空白。

发明内容

本发明的目的在于提供番鸭细小病毒（MDPV）和鹅细小病毒（GPV）双重实时荧光定量PCR检测引物及方法，利用2组引物扩增的目的片段其GC含量的差异所导致的Tm值差异，在SYBR Green II实时荧光定量PCR反应完成后结合熔解曲线峰值的差异来对MDPV和GPV进行快速鉴别诊断和病毒载量分析。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：