[发明专利]一种快速鉴别NDV疫苗株与强毒株的PCR-HRM引物及方法

说明书

本发明公开了一种快速鉴别NDV疫苗株与强毒株的PCR‑HRM引物及方法，PCR‑HRM引物的核苷酸序列如文中所示；鉴别方法包括:RNA提取、反转录、PCR扩增和HRM分析等过程。本发明设计方法特异性好、重复性强、可以准确、快速、高通量地运用于NDV特定疫苗的筛查。

技术领域

本发明涉及病毒序列检测技术领域，更具体地说是涉及一种快速鉴别新城疫病毒疫苗株与强毒株的PCR-HRM引物及方法。

背景技术

新城疫(Newcastle diseases,ND)又叫“亚洲鸡瘟”，俗称“鸡瘟”，是由副粘病毒科副粘病毒属的新城疫病毒引起鸡的一种高度接触性、急性、热性、败血性传染病，主要特征是呼吸困难、下痢、神经机能紊乱、黏膜和浆膜出血。该病发病急、致死率高，对养禽业的发展构成严重的威胁。根据致病力的不同，通常又分为强毒株、中等毒力株和弱毒株。

现有技术中，对新城疫病毒疫苗株的检测和研究数不胜数。上个世纪30年代，Haddow等通过减弱新城疫病毒毒力的研究，研制了中发型活疫苗，目前在一些地方仍然使用；后来研发的毒力更加温和的HitchnerB1和LaSota毒株目前是使用最为普遍的疫苗类型。由于疫苗株的免疫接种的广泛性，且免疫接种后一段时期仍可以排毒，造成疫苗的使用效果不尽人意，而且，NDV疫苗株和强毒株的核苷酸序列没有明显差异，有效鉴别两种病毒株的方法至今未见报道。

因此，如何提供一种快速鉴别NDV疫苗株和强毒株的引物及方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种快速鉴别NDV疫苗株和强毒株的PCR-HRM引物及方法，有利于快速区分NDV疫苗株和强毒株。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种快速鉴别NDV疫苗株与强毒株的PCR-HRM引物，所述PCR-HRM引物的核苷酸序列如下所示：

P1：GGGAAATATGTAATATACAAGCG；或其核苷酸互补序列；

P2：GGTACAAGAAGTGAGATGTCCCTA；或其核苷酸互补序列。

发明人通过反复筛选，设计成以上引物对，以P1为上游引物，同时为限制性引物，P2为下游引物，引物P1和P2包含NDV疫苗株和强毒株的特异基因位点，对其他病原菌无扩增性，进行不对称扩增。有利于临床上对疫苗株的特异性筛查。

一种快速鉴别NDV疫苗株与强毒株的PCR-HRM探针，其特征在于，所述PCR-HRM探针的核苷酸序列如下所示：

Probe1：ACATGCCCAGATGAGCAAGACTACCAGAT。

探针Probe1与目的基因的一段碱基区间序列一样，这样PCR扩增出的序列就可以与探针杂交。

可选的，所述PCR-HRM探针3’端以修饰物进行修饰和封闭。修饰物包括氨基修饰的C6、反向dT或C3spacer，优选C3spacer，其可为寡核苷酸标记提供必要的间隔以减少标记基团与寡核苷酸间的相互作用。C3spacer主要用于模仿核糖的和羟基间的三碳间隔，或“替代”一个序列中未知的碱基。-Spacer C3用于引进一个间臂从而阻止外切酶和聚合酶发挥作用。

一种快速鉴别NDV疫苗株与强毒株的PCR-HRM试剂盒，所述试剂盒包含上述所述的PCR-HRM引物和PCR-HRM探针。

以试剂盒将引物对和探针按照2：1的体积封装，在扩增之前有利于试剂的集体加入，避免了多次操作造成的误差。

一种快速鉴别NDV疫苗株与强毒株的方法，包括以下步骤：

1)从待测样品中提取病毒的RNA，得到RNA样品；