[发明专利]一种NK细胞的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种细胞的制备方法，具体涉及一种NK细胞的制备方法。

背景技术

NK细胞的发现距今已有几十年的历史，其属于固有免疫系统，是人体免疫系统给的第一道防线。NK细胞约占血液中淋巴细胞的5%-10%，特征指标是CD3-CD56+,是一类无T和B细胞特征性标志的淋巴细胞，同时也存在于外周组织中，如肝脏、腹膜腔、胎盘等，在外周血中循环的NK细胞通常处于免疫静止状态，一旦被细胞因子激活，它们会渗透到大多数组织中攻击肿瘤细胞和病毒感染细胞。

NK细胞是固有免疫系统的重要组成部分，是机体抗御感染和防止细胞恶性转化的重要免疫调节细胞，NK细胞识别靶细胞无MHC限制性，可以在无预先致敏的情况下杀伤肿瘤细胞。同时，还可以产生一系列的细胞因子，进而对机体的适应性免疫进行调节，是连接机体固有免疫和特异性免疫的桥梁。鉴于应用NK细胞免疫治疗肿瘤具有良好的临床应用前景，近年来NK细胞一直是国内外学者研究的热点。目前，体外培养激活NK细胞的方法很多，有在培养体系中加入动物血清，也有通过灭火的K562细胞作为饲养层体外刺激NK细胞，或通过基因重组技术向细胞内转入外源基因或通过磁珠分选出NK细胞再体外扩增等等，虽然这些方法能够有效的扩增NK细胞，但过程复杂，成本高、不可控因素较多，安全性有待验证，不适用于临床NK细胞治疗。因此，如何提供一种安全、高效、稳定扩增NK细胞的培养基和培养方法成为目前NK细胞临床治疗亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，现提供一种扩增方法简单，高效，有利于规模化生产的NK细胞的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种NK细胞的制备方法，其创新点在于：经过培养瓶包被、外周血采集、单个核细胞的分离、接种、扩增、细胞收获和鉴定，完成NK细胞的制备；具体步骤如下：

（1）培养瓶包被：1 mg/ml人源化CD16单抗和1 mg/ml OKT-3单抗，用pH7.6-8.2的无菌DPBS梯度稀释抗体至所需浓度，包被T75瓶，每瓶10 ml，4℃过夜或37℃预包被1 h，最优浓度为3 ug/ml人源化CD16单抗和2 ug/ml OKT-3单抗；

（2）外周血采集：客户经三甲医院检测HBV抗原、抗HCV抗体，抗HIV抗体、抗梅毒螺旋体抗体、ALT、支原体的检测项目均为阴性。由专业护士抽取50-80 ml外周血，放于含有肝素锂抗凝剂的10 ml无菌采血管内，4℃保存，12 h内分离；

（3）单个核细胞分离：向50 ml离心管内预先加入15-20 ml淋巴分离液，再缓慢加入25-30 ml混匀的外周血液，进行离心，然后收集上层血浆水浴灭火，吸取白膜层细胞放置到50 ml离心管中，抽取计数样本，补充盐水到50 ml，1500-2000 rpm转速下，离心10 min，重复离心2次；

（4）接种：细胞以1-2×10⁶/ml的密度接种到预先包被的T75培养瓶中，加入20 ml无血清培养基和5%的自体血浆，进行接种培养；

（5）扩增:第3-4天加入等量的无血清培养基，之后每2-3天根据细胞密度加入1-2倍体积的无血清培养基和0-3%的自体血浆，当培养体系超过100 ml时转入T-610培养袋继续培养，所述细胞密度控制在2-3×10⁶/ml，终体系为2000 ml；

（6）细胞收获和鉴定：经过15-18天的扩增，细胞密度达到3-4×10⁶/ml时，将细胞悬液经过2000 rpm转速下，10 min离心后，收集底部细胞沉淀，离心前收集细胞悬液用于计数、活力和流式检测，离心后上清用于菌检，内毒素、支原体检测，细胞用于冻存或其它用途，具体鉴定步骤如下：

a)细胞增殖能力：分别在第0、4、8、12、16天取培养的细胞，用台盼蓝染色计数后，用当天细胞总数除以第0天的细胞数，得到扩增倍数；

b)NK细胞的表型：

取D16天的NK细胞，以DPBS缓冲液制备成浓度为1×10⁸个/ml的细胞悬液,取100 ul细胞悬液放于1.5ml EP管中，分别加入CD3-FITC和CD56-PE抗体各20 ul，4℃避光孵育30 min，加入400 ul的DPBS，1500 rpm 离心6 min，弃上清，加入500 ul DPBS混匀后转移到流式上机管中，上机检测；

c)NK细胞的杀伤活性：