[发明专利]一种氧化石墨烯和壳聚糖微球固定双功能酸性脲酶的方法

权利要求书

1.一种固定化双功能酸性脲酶的方法，其特征在于，采用戊二醛交联氧化石墨烯和壳聚糖微球制备固定化载体，用于固定双功能酸性脲酶的方法，包括以下步骤：

步骤一、首先进行氧化石墨烯（GO）的活化，将GO在缓冲液中超声分散，然后加入EDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺）和NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）在分散液中，震荡活化；然后将壳聚糖用醋酸溶液活化，按壳聚糖和氧化石墨烯质量比1：（1/3~3），将壳聚糖和氧化石墨烯载体的溶液混合反应4~12 h；

步骤二、通过离心获得氧化石墨烯和壳聚糖的沉淀物，加入戊二醛水溶液交联，交联时间4~12 h，去离子水清洗去未交联物质，收集沉淀物、冷冻干燥，得到固定化载体；

步骤三、向氧化石墨烯/壳聚糖交联载体中加入双功能酸性脲酶溶液，4℃反应1~36 h，分离得到加载了酶的载体。

2.根据权利要求1所述的一种方法，其特征在于，戊二醛水溶液的浓度为1%~5%。

3. 根据权利要求1所述的一种方法，其特征在于，步骤二中交联时间4~12 h。

4. 根据权利要求1所述的一种方法，其特征在于，步骤一、称取GO 0.2g在缓冲液中，超声2h使其分散均匀，然后加入5ml 0.5mM EDC和5ml 0.5mM的NHS在分散液中，震荡2h活化，称取0.2g壳聚糖用20mL 2.0%的醋酸溶液活化，震荡2h活化。

5. 根据权利要求1或3所述的一种方法，其特征在于，步骤二、通过离心获得氧化石墨烯和壳聚糖的沉淀物，按每0.03g沉淀物加入4mL 1%~5%(v/v)戊二醛水溶液交联，交联时间4~12 h，去离子水清洗去未交联物质，收集沉淀物，在冷冻干燥机中-65℃冷冻干燥。

6. 根据权利要求1所述的一种方法，其特征在于，步骤三、向0.03g氧化石墨烯/壳聚糖交联载体加入4mL浓度为1mg/mL、比酶活为2U/mg的重组双功能酸性脲酶溶液，在4℃反应1~36 h，收集固定化酶。

7.根据权利要求1~6任一所述方法制备得到的固定化双功能酸性脲酶。

8.权利要求7所述固定化双功能酸性脲酶在去除发酵食品中氨基甲酸乙酯中的应用。