[发明专利]一种蓝猪耳遗传转化方法

说明书

本发明公开了一种蓝猪耳遗传转化方法，该方法涉及遗传工程技术领域，具有操作简单，能快速有效的获得转基因植株的特点。该方法在传统的农杆菌介导的蓝猪耳遗传转化中，加入了表面活性剂——Silwet L‑77，降低了叶片表面张力，使农杆菌充分接触叶片伤口，获得了较高的遗传转化效率。由于传统的遗传转化多采用叶盘诱导丛生芽来获得转基因株系，获得的抗性苗阳性率低，本方法利用愈伤诱导丛生芽的方法获得转基因苗，大大增加了阳性率。本方法对传统的遗传转化过程进行了优化，缩短了转化周期，获得了可稳定遗传的转基因植株，这个优良的转化系统为应用基因工程手段研究被子植物双受精的细胞与分子机制奠定基础。

技术领域

本发明涉及转基因及组织培养技术领域，特别涉及一种蓝猪耳遗传转化方法。

背景技术

蓝猪耳(Torenia fournieri)又名夏堇，属双子叶植物门，合瓣花亚纲，玄参科蓝猪耳属。被子植物的胚囊大多数都是紧密包裹在胚珠珠心组织里，生殖过程的受精机理及代谢活动需借助经典结构植物学研究技术如半薄、超薄切片及组织透明法等[You R L etal.,1985；Jensen W A et al.,1965；Malamy et al.,1997]，才能做进一步研究。若动态的观察被子植物受精过程中卵细胞的变化状态，蓝猪耳更为适合。蓝猪耳雌配子成熟的过程中，胚囊会从珠孔端伸出珠被组织之外。待卵器完全成熟，在光学显微镜下清晰可见。这种特殊的半裸露胚囊结构，为研究被子植物生殖生物学和发育生物学提供了很好的研究材料，对高等植物双受精机理和早期胚胎发育的研究具有重要的意义。

完整的植物组织培养系统与根癌农杆菌介导的遗传转化系统组成了转基因植物构建的一般系统。蓝猪耳茎段和叶片在不同浓度的生长激素相配合的作用下可以诱导出根、芽和愈伤组织等植物器官：1/2MS、6-BA、NAA相结合可以诱导不定芽的产生，而MS、6-BA、2,4-D配合可诱导愈伤组织，生根培养基为1/2MS[Chlyahet al.,1973；Kamadaet al.,1979；佟晓楠等，2004；宾金华等，2004；李梅兰等；2005]；同时花芽和胚也可以作为蓝猪耳组织培养的外植体诱导出植物组织[Tanimotoet al.,1981；Tanimotoet al.,1985]。Aida在1996年就对蓝猪耳分子育种进行了相关研究，初步建立了农杆菌介导的蓝猪耳遗传转化系统。Fukusaki成功诱导出白色和浅色花瓣的转基因株系[Fukuaak et al.,2005]。在蓝猪耳遗传转化的过程中，常以叶片作为外植体，且共培养阶段比较重要，其中菌液浸染植物材料的时间以10～20min为宜，共培养7天转化率达27％以上[Chen B C et al.,2005]。李梅兰认为在共培养阶段暗培养4天效果最佳，且与诱导愈伤再生体系相比，诱芽时间较短，转化效率相同[Li M L et al.,2006]；龙海涛等人利用愈伤诱导系统对蓝猪耳进行遗传转化，该方法转化率达13％～14％[Long H T et al.,2008]。浸染过程是转化过程中重要的步骤，浸染效率直接关系到后期材料的转化率。

发明内容

本发明在已有研究的基础上对浸染条件及后续流程进行了优化，首次在蓝猪耳转化的过程中加入了Silwet L-77，使农杆菌的浸染效率得到了显著提高；并且添加了头孢清洗步骤来去除农杆菌污染，固体培养基上降低了头孢浓度，减少了对抗性芽生长的抑制。通过定位于卵细胞的特异性启动子DD45(DD45是一种特异性表达于卵细胞的启动子，在单子叶植物水稻与双子叶植物拟南芥体内均可表达)，构建载体DD45：MT-GFP，对蓝猪耳卵细胞线粒体进行特异性标记，结果表明，本发明的蓝猪耳遗传转化方法转化率高，且可以稳定遗传。

本发明的目的是按以下技术方案实现的：一种蓝猪耳遗传转化方法所述方法包括：