[发明专利]识别简并序列或四碱基序列的限制性内切酶在接头介导的PCR方法中的应用

说明书

本发明公开了识别简并序列或四碱基序列的限制性内切酶在接头介导的PCR方法中的应用，利用识别简并序列的限制性内切酶或识别四个碱基序列的限制性内切酶可将基因组切割成更多短片段，增加了克隆目的片段的几率。影响接头介导的PCR扩增效率的一个重要因素是所扩增片段的长度。片段越短，扩增越容易。在大多数情况下，长片段不能被Taq DNA聚合酶及其改进的衍生物有效扩增。另一方面，在克隆T‑DNA侧翼序列时，几十个核苷酸信息就能确定插入位点。因此，识别简并序列的酶或识别四个碱基序列的酶将会是更好的选择。

技术领域

本发明涉及识别简并序列或四碱基序列的限制性内切酶在接头介导的PCR方法中的应用。

背景技术

目前有多种克隆T-DNA插入未知侧翼序列的方法存在，比如接头介导的PCR也叫adapter介导的PCR法(简称A PCR)，热不对称交错PCR(TAIL-PCR)，Alu PCR，质粒拯救，反向PCR等等，但克隆效率都较低。目前常用的方法之一是A PCR，所以对于提高A PCR的克隆效率显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，通过识别简并序列或四碱基序列的限制性内切酶在接头介导的PCR方法中的应用，提高克隆未知侧翼序列的效率。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：识别简并序列或四碱基序列的限制性内切酶在接头介导的PCR方法中的应用，采用识别简并序列的限制性内切酶或识别四个碱基序列的限制性内切酶进行酶切。

进一步的，包括以下步骤：

(1)采用识别简并序列的限制性内切酶或识别四个碱基序列的限制性内切酶对基因组进行酶切，纯化回收后得到酶切产物；

(2)将纯化回收的酶切产物和外源接头通过T4DNA ligase进行连接，得到连接液；

(3)将步骤2得到的连接液作为模板，进行PCR扩增。

进一步的，所述步骤2中，纯化回收的酶切产物采用具有限制性内切酶位点的外源接头进行连接。

进一步的，所述识别简并序列的限制性内切酶选自：AccⅠ、BanⅡ(HgiJⅡ)、BmeT110Ⅰ(AvaⅠ)、BspT107Ⅰ(HgiCⅠ)、Cfr10Ⅰ、EaeⅠ(CfrⅠ)、EcoO109Ⅰ(DraⅡ)、EcoT14Ⅰ(StyⅠ)、HaeⅡ、Hin1Ⅰ(AcyⅠ,BbiⅡ)、MflⅠ(XhoⅡ)、BciT130Ⅰ(EcoRⅡ,MvaⅠ)、BcnⅠ(CauⅡ)、Bsp1286Ⅰ(SduⅠ)、VpaK11BⅠ(AvaⅡ)、BmgT120Ⅰ(AsuⅠ,Cfr13Ⅰ)、DdeⅠ、HinfⅠ；所述识别四个碱基序列的限制性内切酶选自HhaⅠ、MboⅠ(Sau3AⅠ)、MspⅠ(HpaⅡ,HapⅡ)、RspRSⅡ(MseⅠ)、TaqⅠ(TthHB8Ⅰ)、XspⅠ(BfaⅠ,MaeⅠ)。

本发明的有益效果在于：识别简并序列的酶或识别四个碱基序列的酶可将基因组切割成更多短片段，增加了克隆目的片段的几率。

附图说明

图1识别简并序列的酶与识别六个碱基序列的酶的对比图；

图2识别四个碱基序列的酶与识别六个碱基序列的酶的对比图。

具体实施方式

目前，T-DNA突变体是突变体的重要资源，A PCR是克隆突变基因的重要方法。本发明通过使用了识别简并序列的限制性内切酶或识别四个碱基序列的限制性内切酶改进了该方法。具体如下：

(1)采用识别简并序列的限制性内切酶或识别四个碱基序列的限制性内切酶对基因组进行酶切，纯化回收后得到酶切产物；

(2)将纯化回收的酶切产物和外源接头通过T4 DNA ligase在16℃进行连接，12小时后得到连接液；