[发明专利]亲和层析柱、制备方法及应用

说明书

本发明涉及生物化学纯化领域，具体而言，提供了一种亲和层析柱、制备方法及应用。本发明提供的亲和层析柱的制备方法，将抗原、还原剂与层析柱填料在层析柱空柱中进行孵育反应，得到反应柱，对反应柱进行洗涤，并对反应柱中多余的结合位点进行封闭处理，得到亲和层析柱。该方法是通过还原剂将抗原中的二硫键打开形成自由巯基，抗原中的巯基与层析柱填料进行共价偶联，通过一次性的缓冲液的洗涤即可保存或使用亲和层析柱，不需要进行梯度洗涤的繁琐步骤，节省人力物力，节约时间，该方法适用于各种抗原可用于工业化生产。本发明提供的亲和层析柱，通过上述制备方法制备得到，性能稳定，成分均匀，可以重复使用，特异性好，可以广泛应用于生产。

技术领域

本发明涉及生物化学纯化技术领域，具体而言，涉及一种亲和层析柱、制备方法及应用。

背景技术

现阶段以重组蛋白作为抗原免疫制备抗体，后续要得到高纯度的特异性抗体，都需要利用亲和层析柱进行抗体的纯化。目前市场上的亲和层析柱主要有两种：一种是将细菌的细胞壁蛋白protein A通过基因工程的手段改造后偶联到琼脂糖凝胶上(如商品化的protein A、protein G等填料)，利用该细胞壁蛋白具有与抗体IgG分子的Fc区特异性结合的结构域，从而将抗体纯化下来。另外一种方法是利用蛋白的游离氨基与共价偶联的配体预活化填料进行化学的共价偶联，从而制作成抗原亲和层析柱进行抗体的纯化。

利用市场上的商品化填料(如protein A、protein G等)，在进行抗体亲和纯化时，虽然能达到抗体的富集的目的，仍存在以下缺点：

(1)纯化得到目的抗体的同时，将免疫动物血清中自带的免疫球蛋白也给纯化下来，从而导致后续检测背景的干扰。

(2)该方法对于特殊亚型的抗体，如IgA，IgE，IgY等都无法进行纯化。

此外，利用蛋白的游离氨基进行共价固定偶联到琼脂糖凝胶上，虽然可以避免将免疫动物血清中自带的免疫球蛋白也给纯化下来，减少检测背景的干扰，但是存在一定的局限性，其缺点如下：

(1)该方法需要偶联的蛋白是可溶性的，否则无法进行有效的共价偶联；而在实际的生产中，由于一些蛋白片段较大，通常是以包涵体的形式存在，即使后续经过变复性的处理，仍有很大一部分的蛋白是以沉淀形式存在。

(2)该方法在偶联时，需要排除一些游离氨基酸及带氨基的化学试剂的干扰，如重组蛋白变性常用的尿素等试剂。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种亲和层析柱的制备方法，以缓解现有技术中对偶联抗原部分有要求，亲和层析柱制备步骤复杂繁琐、费时费力、成本较高的技术问题；

本发明的第二目的在于提供上述制备方法制备亲和层析柱中的应用，以降低现有技术中制备亲和层析柱的物料成本、时间成本和人力成本；

本发明的第三个目的在于提供上述制备方法制备得到的亲和层析柱，以缓解现有技术中纯化目标抗体时操作步骤繁琐，费时费力的问题。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明提供了一种亲和层析柱的制备方法，包括：将抗原、还原剂与层析柱填料在层析柱空柱中进行孵育反应，得到反应柱，对反应柱进行洗涤，并对反应柱中多余的结合位点进行封闭处理，得到亲和层析柱。

进一步地，所述还原剂为二硫苏糖醇、巯基乙醇或三(2-羧乙基)膦。

进一步地，所述层析柱填料可与巯基偶联；

优选地，所述层析柱填料为琼脂糖凝胶；

优选地，所述琼脂糖凝胶为碘乙酰活化的琼脂糖凝胶或环氧基活化的琼脂糖凝胶。

进一步地，所述抗原与还原剂的重量份数比为1-2:2。