[发明专利]含有一个或几个点突变的头孢菌素C酰化酶突变体及其制备方法

说明书

本发明涉及药物生产领域，具体涉及头孢类抗生素生产及其生产用酶，尤其地，涉及含有一个或几个点突变的头孢菌素C酰化酶突变体、编码其的核酸、相关表达载体和宿主细胞、其制备方法和所述突变体用于一步裂解CPC制备7‑ACA的用途。

技术领域

本发明涉及药物生产领域，具体涉及头孢类抗生素生产及其生产用酶，更具体地，涉及含有一个或几个点突变的头孢菌素C酰化酶突变体、编码其的核酸、相关表达载体和宿主细胞、其制备方法和所述突变体用于一步裂解CPC制备7-ACA的用途。

背景技术

7-ACA(7-aminocephalosporanic acid，7-氨基头孢烷酸)是一种非常重要的抗生素合成中间体，可以用来进行多种头孢类抗生素的合成，具有重要的医用价值。工业上，最早期采用化学裂解法裂解头孢菌素C(Cephalosporin C，CPC)制备7-ACA，但是化学法的反应条件较为苛刻，反应过程必须在超低温条件下进行，且涉及大量的有毒有害的有机溶剂，会带来环境污染等问题。因此，近些年来对环境友好的酶法开始成为工业生产的新方向。早期工业化生产采用二步酶法进行催化，第一步，通过D-氨基酸氧化酶(DAO)将CPC转变为戊二基-7-氨基头孢烷酸(GL-7-ACA)；第二步，通过GL-7-ACA酰化酶将GL-7-ACA转变为7-ACA。但是，二步酶法催化时，第一步产生的过氧化氢与DAO底物或反应产物发生反应，产生大量的副产物，且其工艺过程长，控制难，成本高，因此现在更多地采用一步酶法催化CPC裂解反应。

一步酶法催化反应采用的酶为头孢菌素C酰化酶(Cephalosporin C acylase)，可直接催化CPC转变为7-APA。已在若干微生物中发现了对CPC有活性的CPC酰化酶，如假单胞菌属(Pseudomonas Sp.)、巨大芽胞杆菌杆菌(Bacillus megaterium)、气单胞菌属(Aeromnas sp.)、粘性节杆菌(Arthrobacter viscous)等，有些CPC酰化酶的基因已被克隆并测序，如假单胞菌属SE83来源的acyII基因(Matsuda等，J.Bacteriol.169：5821-5829,1987)；假单胞菌属N176来源的CPC酰化酶基因(US5192678)；假单胞菌属V22来源的CPC酰化酶基因(Aramori等，J.Ferment.Bioeng.72：232-243,1991)；泡囊假单胞菌(Pseudomonasvesicularis)B965来源的CPC酰胺水解酶基因(US6297032)；巨大芽孢杆菌来源的CPC酰胺酶基因(US5229274)；以及假单胞菌属130来源的CPC酰化酶基因(Li等，Eur.J.Biochem.262：713-719,1999)。然而，这些CPC酰化酶基因不具有足够的水解活性以裂解CPC第7位上的酰胺键，不适用于由CPC制备7-ACA的一步酶法。因此，为了获得可用于一步酶法制备7-ACA的CPC酰化酶，研究者们对野生型的CPC酰化酶进行了一系列的突变设计，如中国专利CN1836044B(头孢菌素C酰基转移酶突变体及用其制备7－ACA的方法)，要求保护CPC酰基转移酶突变体或其功能等效衍生物，其中CPC酰基转移酶α-亚基中的Val121α、Gly139α和Phe169α和CPC酰基转移酶β-亚基中的Met31β、Phe58β、His70β、Ile75β、Ile176β和Ser471β位点发生取代突变，这些突变体对CPC的反应性增强；CN103060298B(一种头孢菌素C酰化酶突变体及其编码基因与应用)，公开了K171S、M270W、I314S、L535T位点突变；CN102321603B(头孢菌素酰化酶突变体及其编码基因与应用)，涉及H296A、H309V位点突变等；CN102978192B要求保护V288M、H417G、H296等突变。