[发明专利]一种利用特征多肽制备Smad2蛋白特异性抗体的方法及其应用

权利要求书

1.一种利用特征多肽制备Smad2蛋白特异性抗体的方法，其特征在于，所述特征多肽是由SEQ ID NO：1氨基酸序列组成；所述制备方法包括以下步骤：

S1：用所述特征多肽与KLH偶联作为免疫抗原，用所述特征多肽与BSA偶联作为检测抗原；

S2：用PBS将免疫抗原与检测抗原分别稀释为1mg/ml，分装冷冻于-20℃冷藏；

S3：分别用所述免疫抗原与检测抗原免疫动物；

S4：采集被免疫动物的静脉血，4℃放置过夜，4℃、10000rmp离心30min，收集上清；

S5：抗体纯化

(1)将所述特征多肽连接到活化的Sulfolink Resin上，制备抗原亲和柱，1mlSulfolink Resin偶联1mg多肽；

(2)亲和柱用10倍柱体积PBS平衡，流尽溶液；兔血清经0.45 μ m 滤膜过滤；

(3)血清过抗原亲和柱，流尽溶液，收集流穿；

(4)10倍柱体积PBS平衡，流尽溶液；

(5)加入5ml抗体洗脱液，分管收集洗脱液，每管1ml；

(6)收集的洗脱液检测280mm处的吸光度，吸光度大于1.0的组分合并，对PBS透析；

S6：Elisa法确定抗体效价；

SEQ ID NO 1：WLDKVLTQMGSPSVR。

2.根据权利要求1所述的一种利用特征多肽制备Smad2蛋白特异性抗体的方法，其特征在于，步骤S3中用所述免疫抗原与检测抗原免疫动物的具体操作为：

第1天：每种抗原取1ml，加入1ml福氏不完全佐剂，乳化，颈背部皮下多点注射，每种抗原免疫2只新西兰白兔；

第15天：每种抗原取1ml，加入1ml福氏不完全佐剂，乳化，颈背部皮下多点注射，每种抗原免疫2只新西兰白兔；

第29天：每种抗原取1ml，加入1ml福氏不完全佐剂，乳化，颈背部皮下多点注射，每种抗原免疫2只新西兰白兔；

第43天：每种抗原取1ml，加入1ml福氏不完全佐剂，乳化，颈背部皮下多点注射，每种抗原免疫2只新西兰白兔。

3.一种如权利要求1所述方法制备的特异性抗体的应用，其特征在于，将所述特异性抗体应用于检测猪骨骼肌细胞中Smad2蛋白的表达。

4.权利要求3所述的应用，其特征在于，所述特异性抗体在制备检测猪骨骼肌细胞中Smad2蛋白的表达的检测试剂中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述猪骨骼肌为猪背最长肌。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述猪骨骼肌为猪背最长肌。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述检测试剂适用于Westernblot法。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述检测方法具体包括以下步骤：

(1)蛋白的提取：取猪背最长肌组织，研磨，裂解，离心，取离心后的上清液即为蛋白质提取样品，置于-80℃保存备用；

(2)SDS-PAGE凝胶电泳：计算含有50ng总蛋白质对应的加样体积，按照1:4体积比例加入5×SDS上样缓冲液后，混匀100℃水浴变性10min，恢复到常温后，进行上样；浓缩胶80V40min，分离胶100V直到溴酚蓝跑到最底部为止；

(3)转膜：按照标准蛋白maker所指位置，切下目的和内参所在胶的区域，进行转膜，转膜电压为100V，时间为90min，转膜结束后将膜用染液染5min，待看到膜上的蛋白条带后，用TBST缓冲液进行脱色；

(4)免疫反应：

A.封闭：将膜放入含有封闭液的培养皿中，脱色摇床上室温封闭2h，之后洗膜2次，每次5min；

B.一抗的孵育：将所述特异性抗体作为一抗，经过条件优化后，按照1:3000稀释，内参基因GAPDH按照1:3000稀释，将膜放入抗体溶液中，摇床上室温孵育1.5h，一抗孵育结束后，用TBST在脱色摇床上洗3次，每次10min；

C.二抗的孵育：选择羊抗兔IgM作为二抗，按照1:3000稀释二抗，室温下孵育1.5h后，用TBST再次洗3次，最后放入TBST缓冲液中，用于进行化学发光反应；

(5)化学发光反应：将ECL化学发光试剂的A液和B液等体积混合，均匀地涂到硝酸纤维素膜上，放到凝胶成像系统的载物台上曝光；

(6)数据分析：应用Image Lab TM软件分析目标条带的分子量和净光密度值，之后计算目的蛋白的相对表达量，即目的基因的灰度值/内参基因的灰度值，结果用4次的平均数±标准误表示。