[发明专利]一种减少及推迟芽孢杆菌芽孢生成的分子改造方法

说明书

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种减少及推迟芽孢杆菌芽孢生成的分子改造方法，将一种能够特异性延缓及减少芽孢生成的基因通过质粒或基因组重组的方式，在生产菌株中表达，以延长生产菌株的发酵周期，提高发酵菌株的生产效率。所得菌株的出芽孢的比例比对照菌降低50％以上，且生成芽孢的时间滞后12小时以上，十分有利于在稳定期进行的工业发酵生产。

技术领域：

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种减少及推迟芽孢杆菌芽孢生成的分子改造方法，将一种能够特异性延缓及减少芽孢生成的基因通过质粒或基因组重组的方式，在生产菌株中表达，以延长生产菌株的发酵周期，提高发酵菌株的生产效率。

背景技术：

芽孢杆菌生长迅速，发酵密度高，目前在工业/食品行业用酶发酵生产以及制药领域中有着举足轻重的地位；芽孢杆菌生产菌株主要包括枯草芽孢杆菌、解链淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌以及短小芽孢杆菌等，这些菌株顾名思义，在发酵后期，尤其是在高密度培养状态下，细胞会很快进入产芽孢的休眠体形式。在细胞变成芽孢休眠体后，发酵生产活动随即停止。因此，通常会在发酵过程中对培养液成份进行实时调控，以减缓芽孢的生成；此外，还常常通过对生产菌株进行遗传改造，通过人工诱变或基因敲除的方式将相关的转录因子(如SigF等)缺失，从而使生产菌株变成不能形成芽孢的微生物，但这种方式往往也有一些问题存在，一方面是由于芽孢生成是这类微生物固有的生命活动，对其进行强行缺失后会引发一些意想不到的微生物生理生化特性的改变，其结果是，这类生产菌株突变体在发酵生产时存在一定的缺陷，如细胞生物量很难提高，以及宿主细胞的分泌能力变弱等。

近年来，针对芽孢杆菌开展了全面的系统生物学的研究，并且随着芽孢杆菌操作改造效率的提高，许多种属相近的微生物的基因经平行遗传转入芽孢杆菌越来越频繁，芽孢杆菌性状的改变也因此更加快捷。

在本发明中，通过将多种其它来源的微生物基因库转入枯草芽孢杆菌164s中，发现其中编号为2367的基因在枯草芽孢杆菌的表达可明显降低该微生物形成芽孢的比率，并且生成芽孢的时间显著滞后，而其它生物特性没有改变，这一特征可以应用于对芽孢杆菌发酵生产菌株的改造。

发明内容：

本发明要解决的技术问题是提供一种减少及推迟芽孢杆菌芽孢生成的分子改造方法，所述改造是通过在宿主细胞中表达调节基因A来完成的；

所述调节基因A为如下(a)、(b)或(c)所述的基因：

(a)其核苷酸为序列表SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列(即基因2367)或其互补的核苷酸序列；

(b)其核苷酸为与(a)同源性高于90％，且编码具有相同生物学功能蛋白质的序列；

(c)其核苷酸为对(a)所述序列进行局部序列的取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且与(a)所编码蛋白质具有相同生物学功能的序列；

所述调节基因A的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述的改造是通过构建包含上述基因的质粒并转入宿主细胞，或在宿主基因组上整合了表达上述基因的遗传操作来完成；

所述芽孢杆菌，包括但不限于枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌以及解链淀粉芽孢等，其改造完成后，可以在高密度发酵过程中，明显减少并推迟芽孢的生成，因此可用于芽孢杆菌的外源蛋白或多肽类产品的发酵生产。

所述减少及推迟芽孢杆菌芽孢生成的分子改造方法，通过构建包含上述基因的质粒并转入宿主细胞，具体如下：

(1)通过PCR的方式获得调节基因A，并将其构建到表达载体上得到重组载体；

优选地，所述表达载体为pMK4质粒；

进一步地，所述重组载体为pMK4-2367，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；