[发明专利]一种快速高效检测曼氏无针乌贼种群的方法

说明书

本发明涉及一种能够在不损伤环境和物种种群前提下采取环境DNA对曼氏无针乌贼种群进行检测的快速高效检测曼氏无针乌贼种群的方法，采集的eDNA样本取样均取自土壤、泥沙和水等，不会对检测点造成环境负担，不会对物种生存环境造成不利影响；利用特制的引物和探针能够准确、快速并高效地对曼氏无针乌贼DNA进行检测，提高了检测的效率和准确性，降低了检测成本；相较于传动曼氏无针乌贼种群分布检测所利用的现场调查法，具有省时省力、成本低、高效且不会伤害到目标物种或破坏调查点生态系统的优点。

技术领域

本发明涉及一种检测曼氏无针乌贼种群的方法，尤其涉及一种能够在不损伤环境和物种种群前提下采取环境DNA对曼氏无针乌贼种群进行检测的快速高效检测曼氏无针乌贼种群的方法。

背景技术

曼氏无针乌贼（Sepiella japonica）是一年生的中型乌贼。头足纲，乌贼科。俗名叫墨鱼，生长快，肉质鲜美，是一种深受市场欢迎的海味食品。曼氏无针乌贼在我国主要分布于黄海、东海海域，为近距离洄游物种。在我国沿海，曼氏无针乌贼是资源丰厚、产量很好的一种经济头足类。曼氏无针乌贼全身都是宝，食用和药用价值都相当高，上世纪七八十年代曾是我国“四大海产品”之一。它每年产量可达几万吨，其中以东海产量为最高，是东海渔民的主要捕捞对象之一。但过度捕捞导致该物种资源衰竭。

及时掌握曼氏无针乌贼种群的分布格局和种群大小，是物种资源保护和生物多样性保护的重要内容和研究前提。传统的曼氏无针乌贼种群分布监测，主要利用现场调查法，如以网具进行渔获采集。具有耗时费力、成本高、捕获率低、可能会伤害到目标物种或者破坏调查点的生态系统的缺点。环境DNA（eDNA）分析是一种将DNA分析技术与传统方法相结合的生物学研究的新工具。这一方法最早出现于上世纪80年代。之后20年间，随着样品采样、DNA提取、分析和测序等关键技术的突破，eDNA分析发展成为完整的物种分布检测技术手段。其应用从微生物分析扩展到高等水生或半水生物种鉴定、居群乃至生物群落的多样性分析。荧光定量PCR（QuantitativePCR，qPCR）特异性高，能够对DNA进行量化分析，近年来逐渐替代普通PCR，成为eDNA分析的重要手段。设计种间特异的qPCR扩增引物和探针是采用eDNA分析进行曼氏无针乌贼资源监测的关键技术。

目前，关于曼氏无针乌贼种间特异性扩增引物和探针的相关研究还未见报道。建立起曼氏无针乌贼的qPCR分析，实现曼氏无针乌贼的简单、快速、准确、客观的分子鉴定是目前开展曼氏无针乌贼eDNA资源监测急需解决的问题。

中国专利局于2010年6月16日公开了一种曼氏无针乌贼内壳荧光标记方法的发明专利申请，申请公告后CN101731162A，该发明采用茜素络合指示剂作为染色剂，利用茜素络合指示剂的水溶液对曼氏无针乌贼进行浸泡染色，提供了一种新型的标志流放的方法，但其仅能对已经捕获的曼氏无针乌贼进行标志，并不能对野外自然环境中的曼氏无针乌贼种群进行快速有效的检测。

发明内容

为解决传统的曼氏无针乌贼种群分布监测，主要利用现场调查法，如以网具进行渔获采集，具有耗时费力、成本高、捕获率低、可能会伤害到目标物种或者破坏调查点的生态系统等缺点，而现有技术中没有在不损伤环境的前提下对曼氏无针乌贼种群进行快速有效检测的方法等问题，本发明提供了一种能够在不损伤环境和物种种群前提下采取环境DNA对曼氏无针乌贼种群进行检测的快速高效检测曼氏无针乌贼种群的方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。

一种快速高效检测曼氏无针乌贼种群的方法，所述快速高效检测曼氏无针乌贼种群的方法包括以下步骤：

1）提取待检测环境的eDNA样本，对样本进行前处理；

2）将经过前处理的eDNA样本通过DNA抽提试剂盒进行DNA抽提，将抽提后的DNA溶于100μL水中得到DNA样本液；

3）对DNA样本液，采用特制的引物和探针进行qPCR反应；