[发明专利]一种对硝基苄醇丙二酸单酯的生物制备方法

说明书

本发明提供了一种通过双酶催化制备对硝基苄醇丙二酸单酯的方法，包括如下步骤：以2‑氰基乙酸‑(4‑硝基苯基)甲酯为底物，用粪产碱杆菌来源的腈水解酶和粪产碱杆菌来源的酰胺酶进行联合催化而得。本发明方法的产物收率高，副产物少，反应条件温和，且环境污染小，适用于工业化生产。

技术领域

本发明属于生物催化技术领域，具体地说，涉及通过腈水解酶与酰胺酶的联合催化来制备对硝基苄醇丙二酸单酯的方法。

背景技术

式I所示化合物对硝基苄醇丙二酸单酯(或称对硝基苄醇丙二酸单酸酯)是一种多用途的药物中间体，比如是制备美罗培南的重要原料，其英文名为Mono-4-nitrobenzylMalonate，CAS号为77359-11-6，具有较高的市场需求量和广泛的用途。

对硝基苄醇丙二酸单酯的制备方法主要是化学合成法。化学合成方法比如是以丙二酸和对硝基苄醇为原料，经过酯化、碱酸调和精制等步骤制得(参见发明专利US5087734)。然而，化学合成方法能耗大，后处理程序复杂，产物纯度低，易造成环境污染。生物酶催化法具有反应条件温和、催化效率高、环境污染少等突出优点，越来越引起人们的重视。目前的生物酶催化法制备路线是以对硝基苄醇、丙二酸或丙二酸盐为底物，在脂肪酶的催化作用下形成(参见发明专利CN201310454873.5)。但是该方法容易产生副产物丙二酸二对硝基苄酯，降低了产物的纯度。因此，需要进一步研发一种更为绿色、高效、专一性强的酶催化法。

腈水解酶(nitrilase)是生物化工领域中一种重要的酶催化剂，它能直接将腈类化合物中的氰基直接转化为羧基进而获得羧酸。腈水解酶具有很强的底物特异性，对于不同的底物，其催化效率和立体选择性等性能差异很大。受限于底物的结构特异性，对于给定的某一底物，不同的腈水解酶在活性和选择性等方面差异很大。发明人研究发现，当腈水解酶催化式II所示底物2-氰基乙酸-(4-硝基苯基)甲酯反应时，会显示出较强的腈水合酶活性，得到的主要产物不是式I所示的羧酸化合物，而是式III所示酰胺副产物3-氨基-3-氧代丙酸-(4-硝基苯基)甲酯。由于目的产物即化合物I收率低，该方法不具有经济性。

因此，如何避免式III所示酰胺副产物的产生，提高化合物I的收率，成为腈水解酶催化法制备对硝基苄醇丙二酸单酯的关键问题。

发明内容

为了克服现有技术的不足，发明人对腈水解酶催化法进行了深入研究，发现腈水解酶与酰胺酶的组合能够解决上述问题，从而开发出一种产物收率显著提高、底物浓度提高的双酶催化工艺路线。

具体而言，本发明提供了一种制备对硝基苄醇丙二酸单酯的方法，包括如下步骤：

以式II所示化合物2-氰基乙酸-(4-硝基苯基)甲酯为底物，用腈水解酶或者其表达微生物、和酰胺酶或者其表达微生物进行联合催化而得。

在一种优选的实施方式中，上述腈水解酶是粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)来源的腈水解酶。

优选地，上述腈水解酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

MSKVAVIQAASIPFDSVSSVEKAAAILQRVAANGATLAVFPEAFLGGYPKGISFGSVIGNRRPEGRALYQMYVEGAVTLGGPELEALADAVTQTGVYTVMGVIEKMGRTLYCTALTLAPGQGVVGIHRKLMPTGQERLVWGFGDGSTLGTVDTPMGRIGKVICWENYMPALRQTMYAQGTELYCTPTADDRPTWASSMIHIAVEGRVFVLSACQAIRLNNYPESFQKEFALPGEFAPDSYVMHGGSMIVSPTGEVLAGPVFDEETELYAELDMDLLKQANLDFDVYGHYSRPDIFSLHVDTRAKQVVKLQTEDSGE(SEQ ID NO:1)。