[发明专利]利用具有两个可释放结合部位的缀合物的可逆细胞标记

说明书

本发明涉及用于检测生物样本样品中靶部分的方法，所述方法包括：a)提供至少一种具有通式(I)的缀合物A_n‑P‑B_m‑C_q‑X_o (I)其中A:抗原识别部分；P:酶催可降解间隔基；B:第一结合部分；C:第二结合部分；X:检测部分；n,m,q,o:1和100之间的整数，其中B和C相互非共价结合，A和B共价结合到P；b)用至少一种缀合物标记由抗原识别部分A识别的靶部分；c)通过检测部分X检测经标记的靶部分；d)通过破坏B_m和C_q之间的非共价键使C_q‑X_o从经标记靶部分断裂；e)通过酶催降解间隔基P使结合部分B_m从经标记靶部分断裂。该方法可用于识别生物样本上的靶部分。随后，可从样品去除通过缀合物检测的生物样本。

发明背景

本发明涉及用于检测生物样本样品中靶部分的方法，所述方法包括，用缀合物标记靶部分，该缀合物具有抗原识别部分和通过酶催可降解间隔基及非共价结合相互作用连接的检测部分，其中在检测或分离靶部分后，破坏非共价结合相互作用，并使间隔基酶催降解，从而从至少检测部分释放靶细胞。

细胞检测和分离技术，例如磁性细胞分离、流式细胞法或流式分选，是在过去的几年里促进生物医学研究和细胞治疗进展的基本工具。这些技术将靶部分特异标记与具有可检测单元的缀合物组合，所述可检测单元如磁性颗粒，以使细胞保持并因此在磁场中分离，或如荧光染料或过渡金属同位素质量标签，以通过显微法或细胞计数检测和表征细胞。技术挑战仍是检测靶细胞后标记的释放。残余标记可能妨碍或影响下游应用，如序贯分选策略、分子诊断或细胞分析。

在过去的几年里研发了数种可逆标记系统。一种策略利用非共价结合相互作用的特异竞争。US20080255004公开一种用识别靶部分的抗体可逆结合到固体载体(例如，磁性颗粒)的方法，抗体缀合到结合到固体载体的经修饰生物素(如脱硫生物素)和经修饰链霉抗生物素或抗生物素蛋白。与生物素和链霉抗生物素之间的强特异结合比较，经修饰结合配偶体的结合相互作用较弱，因此，在这些竞争体存在下促进解离。EP2725359描述一种用于可逆磁性细胞分离的系统，该系统基于识别靶部分的配体-PEO-生物素-缀合物和包含(compromising)磁性颗粒的抗生物素-抗体的非共价相互作用，磁性颗粒可通过加入竞争分子生物素、链霉抗生物素或助剂释放。

除了这些竞争释放机制外，机械搅拌、化学可断裂或酶催可降解连接体也涉及标记的去除。WO 96/31776描述一种在分离后从靶细胞释放磁性颗粒的方法，方法包括使颗粒包覆的部分，或包覆和抗原识别部分之间连接基中存在的部分酶催断裂。一个实例是用葡聚糖包覆和/或通过葡聚糖连接的磁性颗粒施加到抗原识别部分。随后，通过加入葡聚糖降解酶(葡聚糖酶)，引发经分离靶细胞从磁性颗粒断裂。EP3037821中的相关方法公开用具有酶催可降解间隔基的缀合物根据例如荧光信号检测和分离靶部分。

最近对利用抗原识别部分的技术的关注在增加，抗原识别部分对靶部分的结合由低亲和常数表征。为了保证用那些低亲和性抗原识别部分特异和稳定标记，标记缀合物的结构必须包括抗原识别部分的多聚，这提供高亲和力。在多聚破坏时，低亲和性抗原识别部分可从靶部分解离，从而提供机会尽可能好地从靶部分释放检测部分和抗原识别部分。

这种可逆多聚体染色首先分别由US7776562和US8298782描述，其中多聚由非共价结合相互作用建立。具有Streptag II的示例性低亲和性肽/MHC-单体与streptactin多聚，且在加入竞争分子生物素时多聚可逆。