[发明专利]一种造血干细胞冻存新方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种造血干细胞冻存方法。

背景技术

造血干细胞是血液系统中的成体干细胞，是一个异质性的群体，具有长期自我更新的能力和分化成各类成熟血细胞的潜能。它是研究历史最长且最为深入的一类成体干细胞，对研究各类干细胞，包括肿瘤干细胞，具有重要指导意义。血液系统中的成熟细胞寿命极短，因此在人的一生中，造血干细胞需要根据机体的生理需求适时的补充血液系统各个成熟细胞组分。同时在损伤、炎症等应激状态下，造血干细胞也扮演着调节和维持体内血液系统各个细胞组分的生理平衡的角色。造血干细胞在临床上应用极为广泛，造血干细胞冻存是保证造血干细胞移植成功的关键技术之一，故其冻存方式尤为重要。目前临床造血干细胞冻存有-196℃液氮程控降温保存和-80℃非程控降温保存，前者能长期保存且细胞损伤少，一般可保存23～25年，但操作复杂、设备昂贵，解冻后有细胞凝集现象，后者可保存干细胞1～2年，其操作相对简便、费用低，但保存细胞时间及细胞活性受限。探索一种操作简便、快速、成本低廉及保存时间更长的干细胞冻存方法，对于临床造血干细胞的储存、应用及造血干细胞移植成功具有重要意义。在造血干细胞的冻存中，使用的冻存剂及方法均非常重要。目前应用于-80℃低温保存干细胞的保护剂有二甲基亚砜(下称DMSO)、CP-1、羟乙基淀粉、RPMI1640培养基、人血白蛋白等，不同的保护剂的配方及使用方法差异较大，对干细胞的保存效果与保存时间也存在差异，多数保存细胞的存活率为80％左右，干细胞安全难以保证，一些冻存方法还存在操作复杂缺点。

专利号2015107320043，专利名称为一种造血干细胞冻存新方法的发明专利，我公司目前已经取得该公司的专利技术许可，按照该方案进行造血干细胞冻存细胞存活率远远高于传统冻存方法，我公司研发工程师在该专利方案的基础之上开展了更进一步的研究，目前可以使得细胞存活率更高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种造血干细胞的冷冻保存方法，细胞存活率更高，本发明克服了传统的技术偏见。

为了实现以上目的，本发明的技术方案如下：一种造血干细胞冻存新方法，其特征在于：包括橡皮塞、多孔蓬松海绵单元以及密封容器；

密封容器的顶部设置有一开口，开口上设置有橡皮塞，多孔蓬松海绵单元设置于密封容器内部，多孔蓬松海绵单元的孔径大于3毫米；

第一步，准备一个消毒后的注射器，注射器的针孔插入橡皮塞，利用注射器将密封容器内的空气抽完；

第二步，利用注射器将事先高温处理过的(常温)空气注入到密封容器内，使得密封容器内的压强介于1.5-2.5个大气压之间；

第三步，取造血干细胞保护剂、造血干细胞悬液或骨髓液，体积比为1-2:6；将造血干细胞悬液或骨髓液与造血干细胞保护剂混合均匀，通过注射器注入到密封容器内，轻轻的摇晃密封容器2-3分钟，然后将密封容器放入-80℃冰箱保存12小时；

第四步，取出上述的造血干细胞悬液或骨髓液与造血干细胞保护剂混合液，然后再次利用注射器加入造血干细胞保护剂,造血干细胞保护剂与混合液的体积比为1：3，再次轻轻地摇晃密封容器2-3分钟，然后将密封容器放入-80℃冰箱保存；

所述的造血干细胞保护剂由试剂A和试剂B组成，试剂A与试剂B的体积比为2：3；

所述试剂A由二甲基亚砜、RPMI1640无菌培养基、羟乙基淀粉组成，溶剂为生理盐水，二甲基亚砜、RPMI1640无菌培养基、羟乙基淀粉的质量百分比分别为30％、5％、15％；

所述试剂B为人血白蛋白溶液，人血白蛋白的质量百分比为10％。

更加优选的技术方案，所述的造血干细胞保护剂、造血干细胞悬液或骨髓液的体积比为1.5:6。

以上体积的单位均为ml。

其中第三步中造血干细胞保护剂与混合液的体积比为1：3，混合液指第二步造血干细胞悬液或骨髓液与造血干细胞保护剂混合均匀得到的混合液。

二甲基亚砜(DMSO)具有高极性、高沸点、热稳定性好、与水混溶的特性，能溶于乙醇、丙醇、苯和氯仿等大多数有机物，被誉为“万能溶剂”。