[发明专利]一种无标记多位点整合表达谷氨酰胺酶菌株及其构建方法

说明书

本发明公开了一种无标记多位点整合表达谷氨酰胺酶菌株及其构建方法，属于基因工程领域。本发明的是将谷氨酰胺酶基因在16S rDNA、nprB、nprE、aprE、spo0A、epr、bpr 7个位点整合表达，最终得到了多位点无抗性整合表达谷氨酰胺酶菌株BSM7。本发明得到的BSM1和BSM7，摇瓶发酵24h后，酶活分别为40.5U/mL和85.6U/mL，突变酶活提高了111.4％。BSM7菌株分批补料发酵，在32h左右达到最高酶活，为375.6U/mL。通过遗传稳定性分析发现，BSM7的遗传稳定性远远大于改基因的质粒表达的稳定性。该发明提高了谷氨酰胺酶酶在食品工业的应用潜力。

技术领域

本发明涉及一种无标记多位点整合表达谷氨酰胺酶菌株及其构建方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

谷氨酰胺酶(glutaminase,EC 3.5.1.2)能催化谷氨酰胺脱酰胺基水解形成谷氨酸和氨。近几年来，谷氨酰胺酶在食品和医学领域中应用研究发展迅速，有关这方面的报道也越来越多。通过研究如何减少癌细胞体内的谷氨酰胺酶含量或者活性，削弱癌细胞体内谷氨酰胺的代谢从而抑制肿瘤细胞的生长。谷氨酰胺酶在食品行业中的应用研究也很广泛，谷氨酰胺酶能够催化谷氨酰胺形成谷氨酸，谷氨酸在提高食品中的口感和风味方面具有很重要的作用。L-天冬酰胺酶来源比较广泛，哺乳动物以及微生物中都发现含有谷氨酰胺酶。

发明内容

本发明首先提供了一种枯草芽孢杆菌偏好性的谷氨酰胺酶核苷酸序列是SEQ IDNO.1所示的序列。

本发明还提供了一种表达所述谷氨酰胺酶的基因工程菌。

所述基因工程菌的制备方法，是在SEQ ID NO.1所示序列的基础上，将包括16SrDNA两端同源臂，lox71-zeo-lox66和Hpa II-Mglu的4个部分，通过重叠延伸的方法将4片段延伸成1个片段，得到整合片段，将整合片段转化到宿主菌中即得到B.subtilis基因工程菌，将含有CRE重组酶的质粒转化入该工程菌种，去除抗性标记，即得到无标记的16S rDNA位点整合表达谷氨酰胺酶枯草芽孢杆菌工程菌。

在本发明的一种实施方式中，所述的制备方法，具体是(序列如表1所示)：

(1)以B.subtilis 168基因组为模板，P3/P4和P9/P10为引物，PCR得到16S rDNA两段同源臂，以pMA5-Mglu和p7Z6所示核苷酸序列为模板，P5/P6和P7/P8为引物，PCR即得到Hpa II-Mglu和lox71-zeo-lox66；接着，用PrimeSTAR GXLDNA聚合酶将这4段片段进行融合PCR，得到整合片段。

(2)将上一步得到的整合片段转化入B.subtilis 168，获得有抗性的重组枯草芽孢杆菌工程菌株，将含有CRE重组酶的质粒pDG148转化如该工程菌主，接着，51℃培养24h，获得无抗性整合表达谷氨酰胺酶菌株，命名为BSM1。

(3)以nprB、nprE、aprE、spo0A、epr、bpr基因作为整合表达位点，以P11-P18、P19-P26、P27-P34、P35-P42、P43-P50、P51-P58为引物，重复步骤(1)(2)，相继获得2、3、4、5、6、7位点整合表达谷氨酰胺酶菌株BSM2-BSM7。

本发明在枯草芽孢杆菌偏好性修饰谷氨酰胺酶核酸序列的基础上，通过多位点整合表达谷氨酰胺酶，最终得到7位点整合表达谷氨酰胺酶菌株BSM7，相对于BSM1，酶活提高了120％。BSM7相对于B.subtilis 168/pMA5-Mglu在无抗性条件下，酶活稳定性大大提高本。发明表明整合表达可以通过增加整合表达位点有效的提高谷氨酰胺酶酶活，并且提高了谷氨酰胺酶的稳定性，并提高了该酶的工业应用潜力。本发明所得可用于提高食品中的口感和风味方面的应用和抑制癌细胞生长。

具体实施方式

实施例1含谷氨酰胺酶的重组载体的构建