[发明专利]定量检测转基因玉米中抗虫蛋白Vip3Aa20的酶联免疫试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体涉及到定量检测转基因玉米中抗虫蛋白 Vip3Aa20的酶联免疫试剂盒及其检测方法。

背景技术

苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是一种广泛存在于土壤中的革兰氏阳性菌，在营养生长期分泌具有高抗虫活性的可溶蛋白(Vegetative Insecticidal Proteins,Vip proteins)。在接种15个小时至产孢期，菌液上清均可检测到Vip3蛋白的表达。抗虫蛋白Vip3对鳞翅类(Lepidoptera)昆虫有广泛毒性，当昆虫取食Vip3蛋白后，该蛋白经中肠蛋白酶活化，活化的蛋白穿透围食膜，与中肠细胞的上皮细胞顶膜特异蛋白结合并形成肠穿孔，从而破坏细胞的渗透平衡，引起细胞肿胀裂解，最终导致死亡。因此Vip3基因已成为植物基因工程及转基因育种应用中最具有潜力和应用前景的抗虫基因。其中Vip3Aa基因已成功的被用于转基因棉花和玉米。

但是在转基因作物的飞速发展在带来巨大经济利益的同时，人们也越来越关注转基因作物可能带来的不可预期的食用安全及环境安全性问题，越来越多的国家要求对转基因产品进行检测以实行标识制度。

目前在检测转基因玉米中抗虫蛋白Vip3Aa20的酶联免疫试剂盒方面，美国envirologix只有定性检测试剂盒，国内外尚未有定量检测试剂盒的报道。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

本发明的目的在于提供定量检测转基因玉米中抗虫蛋白Vip3Aa20的酶联免疫试剂盒及其检测方法，其具有操作简便、能同时快速检测大批样品，具有高灵敏度、高特异性的特点。

为实现上述目的，本发明提供了一种定量检测转基因玉米中抗虫蛋白 Vip3Aa20的酶联免疫试剂盒，所述酶联免疫试剂盒由包被捕获抗体的微孔反应板、样品处理液、生物素标记的检测抗体、标准品、辣根过氧化物酶标记的亲和素、生物素标记的抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记的亲和素稀释液、浓缩洗涤液、底物溶液、终止液和板贴组成。

其中，样品处理液的配方为：

生物素标记的检测抗体：100μg/mL生物素标记的Vip3Aa20 1F9-1F5鼠单抗(PBS,50％甘油)溶液；

标准品：2ng的His-Vip3Aa20重组蛋白(冻干粉)，所述His-Vip3Aa20 重组蛋白是通过将Vip3Aa20编码基因进行扩增、测序，鉴定正确以后与 pET28a质粒连接，将重组表达载体pET28a-vip3Aa20转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，保存的重组蛋白Vip3Aa20表达菌株复苏培养，用IPTG 于16℃过夜诱导表达蛋白，并通过重组蛋白纯化得到；

辣根过氧化物酶标记的亲和素：1:40辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase)标记的亲和素(avidin)母溶液(金开瑞公司)，工作液以1:100 倍稀释；

生物素标记的抗体稀释液/辣根过氧化物酶标记的亲和素稀释液配方：

浓缩洗涤液：含有1.0％Tween-20的10×PBS；

底物溶液：0.5mL 2mg/mL TMB无水乙醇溶液，10mL底物缓冲液，32μL 30％H₂O₂混合，现用现配；

终止液：1M H₂SO₄。

所述试剂盒的特性：

1)灵敏度为：10.242pg/mL

2)精密度：批内差CV％<8％，批间差CV％<10％

3)特异性：本试剂盒特异性检测vip3A，且与其他相关蛋白无交叉反应。

上述酶联免疫试剂盒在另一种实施方式中，所述的捕获抗体由保藏号为 CGMCC No.14733的杂交瘤细胞株2G3-1D7分泌得到的，

上述酶联免疫试剂盒在另一种实施方式中，捕获抗体检测范围： 0.03125ng/mL-2ng/mL。

上述酶联免疫试剂盒在另一种实施方式中，所述检测抗体由保藏号为 CGMCC No.14725的杂交瘤细胞株1F9-1F5分泌得到。