[发明专利]一种检测叶螨对阿维菌素抗性相关基因突变的CAPS标记方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术技术领域，具体涉及一种检测叶螨对阿维菌素抗性相关基因突变的CAPS标记方法。

背景技术

二斑叶螨Tetranychus urticae Koch是果树、蔬菜及其他农作物上的世界性重大农业害螨。二斑叶螨以成螨、若螨刺吸为害植物汁液，初期叶片变黄影响光合作用，严重者导致叶片枯死、落叶甚至整株枯死，对农作物健康生长及产品质量带来严重影响。

二斑叶螨由于体型微小、生活史短、世代重叠严重，田间化学药剂的频繁使用导致了其抗药性的出现。据报道，二斑叶螨田间种群已经对不同类型的杀虫剂均产生了不同程度的抗药性（Van Leeuwen et al.，2010；Tang et al., 2014，王玲等，2015），其中尤以对阿维菌素抗药性最为明显，部分地区二斑叶螨种群抗性水平达上千倍（Tang et al., 2014），包括卵期对阿维菌素的抗药性也显著升高（刘庆娟等，2012）。靶标抗性是害虫对杀虫剂产生抗性的重要抗性机制之一，谷氨酸门控氯离子通道（Glutamate-gated chloride channel, GluCl）在叶螨对阿维菌素产生抗药性的相关靶标抗性基因，抗性种群中GluCl1基因第三跨膜区的G314D点突变是导致二斑叶螨对阿维菌素产生抗药性的重要分子机制（Kwon et al., 2010），该突变位点在我国二斑叶螨田间种群也存在，并且抗性基因频率很高（唐小凤等，2014年）。随后研究者又在希腊的一个频繁喷施阿维菌素的温室月季二斑叶螨MAR-AB种群中，发现了GluCl家族的GluCl3基因上存在G326E位点的突变，并证实了该突变也与二斑叶螨对阿维菌素抗性产生抗药性有关（Dernauw et al., 2012）。我国多地二斑叶螨田间种群对阿维菌素抗药性属高抗性或极高抗性水平（Tang et al., 2014），田间种群是否也存在该位点的突变以及突变频率高低尚不明确。

害虫/害螨中抗药性基因一旦发生了突变，即使停用该药剂，也不能回复叶螨对其的敏感性，因此检测抗性基因的突变与否、突变频率的高低，进而明确测试种群的抗药性，对于指导田间下一步药剂的科学选择和施用，很有必要性而且意义重大。常规的害螨抗药性监测方法是基于生物测定方法，比如FAO推荐的玻片浸渍法，应用普遍，但这种方法存在不少缺点：（1）操作过程很精细，需要极小心，才能保证测试叶螨不被伤害；（2）操作者需要较长一段时间来掌握该技术；（3）生物测定过程需要药剂处理后48h才能观察结果，进行害螨死亡率的判断。而基于PCR为基础的基因点突变检测方法需要通过以下几个步骤：基因扩增、片段测序和序列比对等过程来确定抗性相关基因是否发生了突变，但很明显这样的过程费时费力，也耗费更多物力。本实验室前期工作中，我们实验室对二斑叶螨抗性基因片段的序列进行分析比较，发现叶螨抗性和敏感种群之间的抗性基因GluCl3扩增片段由于一个核苷酸的突变导致的酶切位点变化，由此建立一种基于酶切扩增多态性序列（Cleaved Amplified Polymorphic Sequences，简称CAPS）的分子标记技术。这种快速的检测方法更加经济高效，特异性强，节约人力和物力，还可明确测试害虫/螨种群对阿维菌素的抗药性，实现害虫/螨抗药性的早期发现和预警。

发明内容

为了实现对田间种群抗药性的快速检测，本发明克隆了二斑叶螨抗性和敏感种群的GluCl 3基因片段，比较分析二者序列差异的基础上，建立了一种基于抗性基因点突变位点检测的叶螨对阿维菌素抗药性的快速分子检测技术，即酶切扩增多态性序列标记（Cleaved Amplified Polymorphic Sequences，简称CAPS）技术，可以实现叶螨种群/个体抗药性的早期预警，有助于田间种群的抗药性治理和针对性高效防控。

本发明提供的技术方案是：一种检测叶螨对阿维菌素抗性相关基因突变的CAPS标记方法：通过扩增待测叶螨种群中GluCl 3基因包含G326E突变的基因片段，并进行酶切位点分析，其中敏感种群的扩增片段中存在Hinf I酶切位点，而抗性纯合种群中不存在该位点，抗性杂合种群既存在Hinf I酶切位点，也存在无该位点的扩增片段。

所述的检测方法，扩增所用的引物如下：

上游引物：5'-GATCCAAATGCTATTCCTGCC-3'，