[发明专利]一种基于活性炭和柠檬酸的烟草外植体防褐化方法

权利要求书

1.一种基于活性炭和柠檬酸的烟草外植体防褐化方法，其特征在于：包括如下步骤：

步骤（1），种子的消毒；

步骤（2），种子培养：将步骤（1）得到的种子接种到MS培养基中培养，种子发芽长成外植体幼苗，然后用浸泡过生土豆的水涂覆外植体幼苗表面；种子的培养条件为：在培养温度为25±1℃，光照强度30-50μmol/(m²·s)，光照时间为16h/d的条件下培养60d；

步骤（3），烟草外植体预培养：将步骤（2）中得到的外植体幼苗转移并接种于添加有10-15g/L核桃粒且包括有MS基本培养基、4g/L琼脂、30g/L蔗糖的MS预培养固体培养基中培养，控制温度为24℃，光照强度为1500lux，光照时间为10小时/天，培养时间为3天，最后将得到预培养后的外植体，反复接种于MS培养基4-5次，使组织中的酚类物质部分渗入培养基；

步骤（4），烟草外植体组织培养：将步骤（3）中得到的外植体置于MS分化培养基中培养，控制白天温度为28℃，夜间温度为25℃，光照强度为30-50μmol/(m²·s)，光照时间为16小时/天，培养时间为7天，得到外植体愈伤组织；

步骤（5），外植体防褐化培养：将步骤（4）中得到的外植体置于MS防褐化培养基中，控制白天温度为28℃，夜间温度为25℃，光照强度为30-50μmol/(m²·s)，光照时间为16小时/天，培养时间为40天；MS防褐化培养基为MS基本培养基中添加0.3-1.0g/L活性炭、4-8mg/L柠檬酸、30g/L蔗糖和4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.7。

2.根据权利要求1所述的基于活性炭和柠檬酸的烟草外植体防褐化方法，其特征在于：步骤（1）中，种子消毒的具体步骤为：取饱满的烟草种子，然后移至超净工作台上，用75％酒精将种子浸泡30s，无菌水冲洗2遍，再用1％AgNO₃消毒10min，无菌水浸泡清洗5次，用无菌滤纸吸干种子表面水分后进行接种，其中无菌水为经高压灭菌的超纯水。

3.根据权利要求1所述的基于活性炭和维生素C的烟草外植体防褐化方法，其特征在于：步骤（2）中，MS培养基为MS基本培养基中添加30g/L蔗糖和4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.7。

4.根据权利要求1所述的基于活性炭和维生素C的烟草外植体防褐化方法，其特征在于：步骤（4）中，MS分化培养基为MS基本培养基中添加0.5mg/L的萘乙酸NAA、2mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、30g/L蔗糖和4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.7。

5.根据权利要求1所述的基于活性炭和维生素C的烟草外植体防褐化方法，其特征在于：步骤（6）中，MS防褐化培养基的制备方法如下：

配制1L MS防褐化培养基：将4.43g MS基本培养基、30g蔗糖和1L超纯水混合，并调节培养基的pH值为5.7；添加4-8mg/L柠檬酸，0.3-1.0g/L活性炭和4g琼脂，121℃灭菌15min；

灭菌后，摇匀培养基。