[发明专利]一种心肌细胞分离提纯方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物细胞培养技术领域，具体涉及一种心肌细胞分离提纯方法。

背景技术

各种基因敲除及转基因小鼠已广泛应用于心血管疾病动物模型的建立，已为心血管疾病机制的研究作出了巨大贡献。体外心肌细胞培养作为一种体外实验研究模型，可以排除神经、体液的干扰而独立地从细胞和分子水平研究心血管疾病的发生、发展机制，目前的工具鼠多为小鼠背景，而心肌细胞水平的研究多采用大鼠乳鼠心肌细胞，相较于大鼠心肌原代细胞的分离纯化技术及比较成熟的H9C2细胞系体系，小鼠心肌原代细胞的分离纯化明显不足。目前心肌原代细胞分离方法多采用胰酶胶原酶联合消化或单一胶原酶消化，心肌细胞纯化多采用差速贴壁法。

采用胰酶胶原酶联合消化的缺陷是：胰酶对心肌细胞有一定的损伤极大地影响了心肌细胞的存活率，当前虽极力减少细胞与胰酶的接触时间及减少胰酶的消化时间，但对心肌细胞存活率的影响依然存在，这在小鼠心肌原代分离纯化过程中尤为明显。

采用单一胶原酶消化的缺陷是：虽然胶原酶作用较缓和，对细胞损伤较小，但后期需用化学抑制剂(如5-溴脱氧尿嘧啶)抑制成纤维细胞生长以期纯化心肌。在小鼠心肌原代细胞培养中依然存在细胞存活率低、纯度不高等缺陷，且化学抑制剂的存在是否影响心肌细胞的功能，尚有待证明，且化学抑制剂的存在将增加实验本身的影响因素，使结果出现难以预计的偏倚。

同时，采用差速贴壁法进行心肌原代细胞分离纯化的过程普遍需要3-3.5小时，纯度、存活率在90％左右，且难以同时兼顾纯度和存活率两个方面。

发明内容

针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种心肌细胞分离提纯方法，细胞存活率高、纯度高。

为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：一种心肌细胞分离提纯方法，包括：

S1，将配好的包被液加入于六孔板中，37℃孵育；

S2，配制心肌缓冲液，将心肌缓冲液加入培养皿中，取心脏置于装有心肌缓冲液的培养皿中漂洗；

S3，剪下的心脏组织置于装有心肌缓冲液的离心管中；

S4，将0.05％Ⅱ型胶原酶加入装有心脏组织的离心管中，摇床培养，弃上清；

S5，将0.1％Ⅱ型胶原酶加入步骤S4处理后的离心管中，摇床培养，取上清放入装有血清的离心管中混匀；

S6，上清混匀后过滤、离心，离心后用心肌缓冲液重悬，将细胞悬液加入离心管中；

S7，配制密度梯度液，将细胞悬液缓慢加入配好的密度梯度液中，进行离心；

S8，离心后可见液面分层，先吸出最上层，再吸出中间层，将吸出的中间层置于离心管中，进行离心，离心后用10％不含青链霉素的胎牛血清溶液重悬，计数后将细胞接种于S1中漂洗好的六孔板中，置于37℃、5％CO₂温箱中培养。

在上述技术方案的基础上，所述包被液为层粘连蛋白包被液、多聚赖氨酸包被液和明胶包被液中的一种。

在上述技术方案的基础上，按质量份计，所述心肌缓冲液包括7.012-8.007份Nacl，0.395-0.403份Kcl，0.123-0.222份MgSO₄.7H₂O，0.973-1.046份葡萄糖，0.060-0.077份KH₂PO₄，0.042-0.071份Na₂HPO₄，4.766-5.958份4-羟乙基哌嗪乙磺酸。

在上述技术方案的基础上，所述心肌缓冲液还包括超纯水和NaOH，所述心肌缓冲液用超纯水定容，用NaOH调整PH至7.5。

在上述技术方案的基础上，所述密度梯度液由高密度液和低密度液配制而成，所述高密度液包括超纯水、Percoll液和缓冲液，其体积比为1：3：1；所述低密度液包括超纯水、Percoll液和缓冲液，其体积比为2：2：1；

按质量份计，所述缓冲液包括35.064-40.032份Nacl，1.975-2.013份Kcl，0.615-1.107份MgSO₄.7H₂O，4.865-5.226份葡萄糖，0.301-0.384份KH₂PO₄，0.213-0.365份Na₂HPO₄，23.830-29.788份4-羟乙基哌嗪乙磺酸。

在上述技术方案的基础上，所述密度梯度液由高密度液和低密度液按体积比4:5配制而成。