[发明专利]一种用于检测胶基型嚼烟细胞毒性的方法

权利要求书

1.一种用于检测胶基型嚼烟细胞毒性的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤（1），样品前处理：将胶基型嚼烟制品加入到37℃的口腔角质细胞培养基中，胶基型嚼烟制品的质量与口腔角质细胞培养基的体积比为1g：10mL；之后于37℃下研磨10min，之后过滤，向滤液中加入血清，使得血清的最终体积百分浓度为10%，得到待测液；

步骤（2），单细胞悬液的制备：将人口腔角质细胞HOK于37℃、5%CO2培养箱中采用口腔角质细胞培养基培养，待细胞汇合率为80～90%时移除培养基，用pH值为7.2的磷酸缓冲液洗两次，弃洗液；加入浓度为0.25%（w/v）的胰蛋白酶溶液进行单层孵育1～2min，每25cm2生长面积的细胞需要加入浓度为0.25%（w/v）的胰蛋白酶溶液1～2mL，单层孵育后再加入口腔角质细胞培养基将细胞悬起，得到单细胞悬浮液；

步骤（3），单细胞悬浮液的细胞浓度计算：用血球计数板计数法对步骤（2）所得单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，计算出每毫升单细胞悬浮液的活细胞数；

步骤（4），细胞接种：将步骤（3）计数后的单细胞悬浮液用口腔角质细胞培养基稀释至1.0～1.5×105个/mL，再按接种量为200μL/孔接种到细胞培养板中，之后将细胞培养板置于37℃、5%CO2培养箱内培养24h；

步骤（5），受试物暴露：受试物分为四组：空白对照组、细胞对照组、阳性对照组和检测样品组；

移除步骤（4）中细胞培养板内的培养基，再按上述方法进行分组，每组多个复孔，同时空白对照组相应的孔内要求无细胞；在空白对照组和细胞对照组相应的孔内加入口腔角质细胞培养基；在阳性对照组相应的孔内加200μg/mL的十二烷基硫酸钠溶液；在检测样品组相应的孔内加入口腔角质细胞培养基和不同剂量步骤（1）所得待测液，至待测液的体积百分浓度在大于0%、小于等于60%的范围内；空白对照组、细胞对照组、阳性对照组和检测样品组的终体积为200μl/孔；

步骤（6），孵育受试物：将步骤（5）加样后的细胞培养板置于37℃、5%CO2培养箱中孵育24h；

步骤（7），染料孵育：在步骤（6）孵育后的检测样品组、空白对照组、细胞对照组和阳性对照组去除细胞培养基，加入浓度为100μg/mL的中性红溶液200μL/孔，再置于37℃、5%CO2培养箱中孵育4h后移除中性红溶液，加入浓度为1%（v/v）的甲醛溶液200μL/孔，固定1min后移除甲醛溶液，之后加入配制好的中性红萃取液200μL/孔，之后振荡10min；

所述的中性红萃取液由无水乙醇、冰醋酸和无菌去离子水按照体积比为50:1:49比例配制而成；

步骤（8），测定吸光值：将步骤（7）处理后的检测样品组、空白对照组、细胞对照组和阳性对照组，用酶标仪在540nm波长下检测吸光值；

步骤（9），计算细胞抑制率：根据步骤（8）所得吸光值，按照下列公式计算细胞抑制率：

式中：

当ODn为阳性对照组多孔平均的吸光值时，X为阳性对照组的细胞抑制率；当ODn为检测样品组某一浓度多孔平均的吸光值时，X为检测样品该浓度下的细胞抑制率；

ODo——步骤（8）所得空白对照组多孔平均的吸光值；

ODc——步骤（8）所得细胞对照组多孔平均的吸光值；

首先，计算阳性对照组的细胞抑制率；当阳性对照组的细胞抑制率不大于90%时，则表明试验无效，需重新按照步骤（1）-步骤（8）进行试验；当阳性对照组的细胞抑制率大于90%时，则表明试验有效，然后计算检测样品组各浓度下的细胞抑制率并绘制细胞抑制率-浓度的曲线，所得曲线表征该胶基型嚼烟细胞毒性。