[发明专利]肺动脉高压治疗药物的干细胞筛选模型及应用在审
| 申请号： | 201711341395.1 | 申请日： | 2015-08-05 |
| 公开（公告）号： | CN108070566A | 公开（公告）日： | 2018-05-25 |
| 发明（设计）人： | 杨隽;周芳;宫世强;韦清霞;赵双;司书毅 | 申请（专利权）人： | 中国医学科学院基础医学研究所 |
| 主分类号： | C12N5/10 | 分类号： | C12N5/10;C12N15/12;C12N15/85;C12Q1/02 |
| 代理公司： | 北京华科联合专利事务所(普通合伙) 11130 | 代理人： | 杨厚;王为 |
| 地址： | 100005*** | 国省代码： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 肺动脉高压 治疗药物 骨形态形成蛋白 报告基因 筛选模型 调节剂 细胞株 应用 治疗肺动脉高压 基因检测系统 抗肺动脉高压 人胚胎干细胞 受体表达水平 血管疾病治疗 肺动脉血流 肺血管重构 干细胞技术 基因组构建 细胞裂解液 关键基因 裂解细胞 稳定表达 药物筛选 荧光素酶 重组载体 动力学 表达量 干细胞 启动子 靶点 筛选 转入 驱动 刺激 检测 | ||
1.一种保藏编号为CGMCC11091的细胞株。
2.一种筛选抗肺动脉高压的化合物的模型，所述模型特征在于，
以BMP信号下游关键基因Id1基因为靶点，设计双报告基因原件插入Id1基因组构建重组载体，并转入人胚胎干细胞株，获得稳定表达的CGMCC11091的细胞株，将待测抗肺动脉高压的化合物刺激CGMCC11091的细胞株，再用细胞裂解液裂解细胞，按基因检测系统所述方法检测荧光素酶表达活性，以Id1启动子驱动的双报告基因表达量作为指标，获得对Id1表达上调的治疗肺动脉高压化合物的筛选模型。
3.构建权利要求2所述模型的方法，其特征在于，步骤如下：
(1)从数据库中找到Id1基因的基因组序列，确定打靶位点为其外显子1，检索包含Id1基因完整序列的BAC质粒(5’和3’上下游5Kb序列)；
(2)生物信息学分析：利用AOS电脑程序，设计并选择最优的位于Id1基因1号外显子ATG下游231bp的U5和D3位点，用于重组打靶；
(3)PCR反应产生基因特异性重组片段：
用于扩增重组片段的引物是由通用引物序列和Id1基因序列共同组成，电转将抗性筛选框插入已诱导重组酶活性的BAC质粒中，获得带筛选框的BAC-Id1质粒；
(4)中间载体的构建：
将一个基于Psc101质粒框架、四环素(Tet)诱导重组的质粒Psc101gbaA，转化至携带含Id1基因BAC质粒(BAC-Id1)的E.Coli克隆中；通过第一次同源重组将带有gateway R1/R2位点和细菌正(zeocin)负(pheS)筛选标记的DNA片段插入到BAC-Id1质粒U5/D3位点中；第二次同源重组将带有R3和R4两个gateway位点的pBR322质粒片断与BAC-Id1进行gap-repair反应，获得中间载体；
(5)目的重组载体的构建：
目的载体的构建基于Gateway系统的三个质粒：本发明构建的中间载体和含有靶向元件的pL1L2_BacT质粒以及含负筛选标记的pL3L4_DTA质粒组成。经两次gateway的转换体系，最终产生高拷贝的目的重组载体Id1-Venus-Luc-MC1-DTA；
(6)筛选细胞株的获得
将Id1-Venus-Luc-MC1-DTA质粒用AsiSI线性化处理，电转P57代人胚胎干细胞H9，获得整合型Id1启动子驱动Venus-Luci双报告基因表达的人胚胎干细胞株，得到CGMCC11091的细胞株，进行早期中胚层分化，将待测抗肺动脉高压的化合物和CGMCC11091的细胞株接触，再用细胞裂解液裂解细胞，按基因检测系统所述方法检测荧光素酶表达活性，以Id1启动子驱动的双报告基因表达量作为指标，获得对Id1表达上调的治疗肺动脉高压化合物的筛选模型。
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