[发明专利]用于心肌细胞分离提纯的试剂盒及使用方法

权利要求书

1.一种用于心肌细胞分离提纯的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括第一试剂混合物、第二试剂混合物和第三试剂混合物，其中：

所述第一试剂混合物包括7.012-8.007份Nacl，0.395-0.403份Kcl，0.123-0.222份MgSO₄.7H₂O，0.973-1.046份葡萄糖，0.060-0.077份KH₂PO₄，0.042-0.071份Na₂HPO₄，4.766-5.958份4-羟乙基哌嗪乙磺酸；

所述第二试剂混合物包括超纯水、Percoll液和缓冲液，其体积比为1：3：1；

所述第三试剂混合物包括超纯水、Percoll液和缓冲液，其体积比为2：2：1；

所述第二试剂混合物和第三试剂混合物中的缓冲液包括35.064-40.032份Nacl，1.975-2.013份Kcl，0.615-1.107份MgSO₄.7H₂O，4.865-5.226份葡萄糖，0.301-0.384份KH₂PO₄，0.213-0.365份Na₂HPO₄，23.830-29.788份4-羟乙基哌嗪乙磺酸。

2.如权利要求1所述的一种用于心肌细胞分离提纯的试剂盒，其特征在于：所述第一试剂混合物用超纯水定容，用NaOH调整PH至7.5。

3.如权利要求1所述的一种用于心肌细胞分离提纯的试剂盒，其特征在于：所述缓冲液还包括超纯水和NaOH，所述缓冲液用超纯水定容，用NaOH调整PH至7.5。

4.如权利要求1所述的一种用于心肌细胞分离提纯的试剂盒，其特征在于：所述第一试剂混合物为粉末或溶液。

5.一种如权利要求1-4任意一项所述的用于心肌细胞分离提纯的试剂盒的使用方法，其特征在于：

S1，将配好的包被液加入于六孔板中，37℃孵育；

S2，使用第一试剂混合物配制心肌缓冲液，将心肌缓冲液加入培养皿中，取心脏置于装有心肌缓冲液的培养皿中漂洗；

S3，剪下的心脏组织置于装有心肌缓冲液的离心管中；

S4，将0.05％Ⅱ型胶原酶加入装有心脏组织的离心管中，摇床培养，弃上清；

S5，将0.1％Ⅱ型胶原酶加入步骤S4处理后的离心管中，摇床培养，取上清放入装有血清的离心管中混匀；

S6，上清混匀后过滤、离心，离心后用心肌缓冲液重悬，将细胞悬液加入离心管中；

S7，使用第二试剂混合物和第三试剂混合物配制密度梯度液，将细胞悬液缓慢加入配好的密度梯度液中，进行离心；

S8，离心后可见液面分层，先吸出最上层，再吸出中间层，将吸出的中间层置于离心管中，进行离心，离心后用10％不含青链霉素的胎牛血清溶液重悬，计数后将细胞接种于S1中漂洗好的六孔板中，置于37℃、5％CO₂温箱中培养。

6.如权利要求5所述的用于心肌细胞分离提纯的试剂盒的使用方法，其特征在于：使用所述第二试剂混合物和所述第三试剂混合物按体积比4:5配制所述密度梯度液。

7.如权利要求5所述的用于心肌细胞分离提纯的试剂盒的使用方法，其特征在于：所述密度梯度液配制方法为：将第二试剂混合物悬空滴加入离心管中，再缓慢加入第三试剂混合物。

8.如权利要求5所述的用于心肌细胞分离提纯的试剂盒的使用方法，其特征在于：所述包被液为层粘连蛋白包被液、多聚赖氨酸包被液和明胶包被液中的一种。

9.如权利要求5所述的用于心肌细胞分离提纯的试剂盒的使用方法，其特征在于：所述层粘连蛋白包被液由1ug/ul层粘连蛋白于磷酸盐第一试剂混合物中稀释至10ug/ml制成。

10.如权利要求5所述的用于心肌细胞分离提纯的试剂盒的使用方法，其特征在于：所述明胶包被液由明胶溶于水中配制而成，其中明胶浓度为1.5％。